鄭程莉 劉太秀周 磊 汪曉鄆

(四川養(yǎng)麝研究所，成都，611845)稿件運行過程

圈養(yǎng)黑熊妊娠中后期尿液中孕酮含量變化研究

鄭程莉 劉太秀1周 磊 汪曉鄆

(四川養(yǎng)麝研究所，成都，611845)稿件運行過程

圈養(yǎng)黑熊；孕酮；酶聯(lián)免疫技術；妊娠期

為研究圈養(yǎng)雌性黑熊(Ursusthibetanus)妊娠中后期尿液中孕酮含量變化規(guī)律，試驗采用酶聯(lián)免疫技術，2016年10月11日開始，至12月13日止，連續(xù)2個月測定四川養(yǎng)麝研究所黑熊養(yǎng)殖試驗場6頭圈養(yǎng)母熊妊娠中后期孕酮的含量變化。試驗結(jié)果表明：(1)試驗組3頭圈養(yǎng)繁殖母熊孕酮含量最高值為39.54 ng/mL，最低值2.45 ng/mL，其中孕酮含量測定值在11月可達10 ng/mL以上；對照組3頭取膽母熊，孕酮含量最高值32.62 ng/mL，最低值0.05 ng/mL，其孕酮含量在11月和12月均在10 ng/mL以下；(2)試驗組3頭母熊尿液中孕酮含量呈現(xiàn)有規(guī)律的波動式變化，且3頭配種母熊孕酮有1～2個峰值；對照組3頭未配種取膽母熊孕酮值呈無規(guī)律性變化，其孕酮值顯著低于試驗組。研究表明：試驗組3頭母熊均順利產(chǎn)仔，配種圈養(yǎng)黑熊尿液孕酮含量變化能反映其妊娠期間胎盤發(fā)育情況，通過測定圈養(yǎng)黑熊孕酮含量的變化規(guī)律對判斷圈養(yǎng)黑熊妊娠將起到指導作用。

由于黑熊(Ursusthibetanus)是國家Ⅱ級保護野生動物，馴化程度不夠，人不易接近。黑熊在配種后，受精卵并不是立即著床發(fā)育，而是在子宮內(nèi)游離一段時間后，在11月底或12月初開始著床，胎兒發(fā)育在最后6～8周內(nèi)完成，產(chǎn)仔多在翌年的1～2月[1]。母熊的腹圍在臨產(chǎn)前1個月左右才有增大，但不甚明顯，尤其在圈養(yǎng)條件下，難以判斷其妊娠與否。因黑熊在冬季妊娠，并且有冬眠現(xiàn)象，有時會因人為疏忽導致其產(chǎn)仔未能及時得到護理，造成新生幼熊死亡。為了提高新生幼熊成活率，預測母熊妊娠時間，顯得尤為重要。

目前，有關黑熊早期妊娠診斷的研究報道為數(shù)不多，文泓淳等[2]最早采用多普勒法和激素對抗法對疑似妊娠而拖延取膽汁手術的3例雌黑熊進行了妊娠診斷，結(jié)果可對未妊娠個體進行診斷，但是對妊娠黑熊的診斷效果尚不清楚。鄭紅華等[3]采用人用妊娠診斷盒制劑和MCD-I型檢測儀對母熊進行早期妊娠診斷，準確率較高，但是亦對檢測時間和固定方法要求較高。金花子等[4]采用放射免疫測定法(RIA)進行了圈養(yǎng)黑熊妊娠診斷初步研究，發(fā)現(xiàn)以妊娠著床期血清孕酮含量大于或等于4.38 ng/mL作為雌性黑熊妊娠依據(jù)。由于黑熊屬于兇猛動物，必須要對其進行麻醉，才能獲得血清，但是麻醉藥物會對妊娠黑熊胎兒造成影響，這種預測方法不能推廣應用。

1993年，郭偉等[5]首次采用定性酶標藥盒較準確地測出了大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)交配后尿中PCG，從而確定大熊貓是否受孕。之前，我們已采用酶聯(lián)免疫技術對圈養(yǎng)黑熊發(fā)情周期尿液中雌二醇、孕酮含量變化進行研究，發(fā)現(xiàn)雌二醇是啟動圈養(yǎng)黑熊繁殖發(fā)情的重要因素[6]。為了能對黑熊進行早期妊娠診斷，本試驗采用酶聯(lián)免疫分析法測定圈養(yǎng)黑熊尿液中妊娠中后期孕酮變化情況，以期準確判斷配種圈養(yǎng)黑熊妊娠與否。

1 材料

1.1 試驗動物

根據(jù)雌性黑熊的繁殖特點，選擇5～16歲，身體健康，發(fā)育健全，繁殖機能正常的雌性黑熊6頭，分為試驗組和對照組，其中試驗組3頭為繁殖母熊，編號分別為0204、06、74，3頭圈養(yǎng)黑熊均為2016年產(chǎn)過幼仔的繁殖母熊，已參與2016年配種計劃；對照組3頭為取膽母熊，編號分別為0511、9914、0307，未參與2016年配種計劃，但0511、0307分別于上一年度參與配種計劃，并于2016年2月產(chǎn)仔，均由四川養(yǎng)麝研究所養(yǎng)熊場提供。

1.2 尿樣收集

為排除性激素水平日常波動的干擾，只取早晨新鮮尿液，取樣時間從2016年10月13日持續(xù)到12月13日，共計取樣10次。每周二早晨收集黑熊第1次晨尿10 mL，以3 000 r/min離心15 min，然后取上清液，置-20℃保存待用。

1.3 檢測試劑

雌二醇/孕酮酶聯(lián)免疫法定量試劑盒，購自北京北方生物技術研究所。

1.4 主要儀器

酶標分析儀(工作波長為450 nm)，由安圖實驗儀器(鄭州)有限公司生產(chǎn)，儀器型號為PHOMO.。

2 方法

激素測定采用酶聯(lián)免疫競爭法測定尿液中雌二醇、孕酮含量[6]。所有的數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)間的差異顯著性釆用SPSS統(tǒng)計軟件的單樣本t檢驗分析得出。利用Excel繪制測定圈養(yǎng)黑熊妊娠期的激素變化趨勢圖并進行分析比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 圈養(yǎng)黑熊雌二醇、孕酮含量的分析

通過測定6只圈養(yǎng)黑熊10～12月之間尿液中雌二醇、孕酮含量變化，發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)參配母熊的雌二醇的含量基本一致，孕酮的含量呈現(xiàn)一定的規(guī)律。在妊娠中后期，3頭試驗配種母熊、3頭對照組取膽母熊雌二醇和孕酮的基本情況見表1。

表1 妊娠期圈養(yǎng)參配黑熊雌二醇和孕酮含量基本情況

Tab.1 The content of estradiol and progesterone in captive black bear

注：同列數(shù)據(jù)肩標大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無肩標表示差異不顯著(P>0.05)

Note：The capital letter with column data showed very significant difference(P<0.01)，no capital letter showed no significant difference(P>0.05)

從表1所列的結(jié)果可以看出，6頭黑熊的雌二醇含量差異不顯著；編號為06、74、9914母熊的孕酮含量在整個測定周期內(nèi)差異極顯著(P<0.01)，呈現(xiàn)2～3個峰值，波動較大，06、74孕酮含量均值高，而9914孕酮含量均值最低。

3.2 0204號繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的動態(tài)變化

從圖1可以看出，0204號圈養(yǎng)黑熊孕酮檢測值在第1次(10月11日)出現(xiàn)最高39.54 ng/mL，隨后逐漸下降趨勢，但是在第6次采樣時(11月15日)，孕酮的值出現(xiàn)升高(17.61 ng/mL)，但隨之降低，整個檢測期中呈現(xiàn)波浪式變化規(guī)律。

圖1 0204號繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的變化Fig.1 The changes of progesterone in the number 0204 of femalereproductive bear during the middle and late pregnancy

3.3 06號繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的動態(tài)變化

從圖2可以看出，06號孕酮變化曲線呈現(xiàn)“山”字形，孕酮第1個波峰的值為17.08 ng/mL，但是孕酮的最高值出現(xiàn)在第6次采樣時間段(11月15日)，其值為26.39 ng/mL，在最后12月13日檢測值較其他5頭母熊高出許多，達23.09 ng/mL。

3.4 74號繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的動態(tài)變化

從圖3可以看出，74號的孕酮變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律變化，檢測期間孕酮值在較高水平上變化，孕酮共出現(xiàn)3個高值，孕酮的最高含量為31.90 ng/mL，孕酮的最低含量為5.99 ng/mL，遠遠高于其他5頭。

圖2 06號繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的變化Fig.2 The changes of progesterone in the number 06 of female reproductive bear during the middle and late pregnancy

圖3 74號繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的變化Fig.3 The changes of progesterone in the number 74 of femalereproductive bear during the middle and late pregnancy

3.5 0511號取膽母熊尿液中孕酮的動態(tài)變化

從圖4可以看出，0511號孕酮值在第3次檢測出現(xiàn)峰值(10月25日)28.05 ng/mL隨后逐漸降低，在最后一次采樣(12月13日)出現(xiàn)最低值。

圖4 0511號取膽母熊尿液中孕酮含量的變化Fig.4 The changes of progesterone content in the number 0511 of urine female bear

3.6 0307號取膽母熊尿液中孕酮的動態(tài)變化

從圖5可以看出，0307號孕酮檢測值在第1次(10月11日)出現(xiàn)孕酮的最高含量為32.62 ng/mL，隨后逐漸降低，在最后一次采樣出現(xiàn)孕酮的最低含量值為1.62 ng/mL。

3.7 9914號取膽母熊尿液中孕酮的動態(tài)變化

從圖6可以看出，9914號的孕酮值都較低水平上呈波浪式變動，最高值僅為2.73 ng/mL，在最后一次采樣時又出現(xiàn)降低，孕酮的最低含量為0.45 ng/mL，為同一個波谷。

圖5 0307號取膽母熊尿液中孕酮含量的變化Fig.5 The changes of progesterone content in the number 0307 of urine female bear

圖6 9914號取膽母熊尿液中孕酮含量的變化Fig.6 The changes of progesterone content in the number 9914 of female bear urine

3.8 產(chǎn)仔情況統(tǒng)計

試驗組的3頭黑熊，0204、74、06分別于2017年1月13日、1月13日和2月13日產(chǎn)仔，均為雙胎；而對照組的3頭黑熊均未產(chǎn)仔。

與孕酮檢測值結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)在11月之后，孕酮測量值高于10 ng/mL的個體，能夠產(chǎn)仔；在10月檢出的高孕酮含量，不能對圈養(yǎng)黑熊是否產(chǎn)仔起指導作用。

4 討論

為了對黑熊進行早期妊娠診斷，本試驗應用酶聯(lián)免疫法測定了妊娠期圈養(yǎng)黑熊的雌二醇和孕酮含量。在本試驗中，雌二醇含量基本維持在300 pg/mL左右，且變化幅度不大，而前期的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)情期雌二醇的峰值含量為1 000 pg/mL左右[6]，對比顯示妊娠期雌二醇含量基本維持在較低水平，進一步證實了雌二醇對圈養(yǎng)黑熊繁殖發(fā)情非常重要。

對6頭黑熊妊娠中后期孕酮含量進行分析，發(fā)現(xiàn)0511和0307的孕酮含量在檢測初期最高，隨后整個下降趨勢明顯，而9914的孕酮含量一直維持在較低水平，這與黑熊的未妊娠表現(xiàn)相一致。根據(jù)資料顯示，9914未曾配種產(chǎn)仔，而0511、0307于2016年2月產(chǎn)仔，分析原因可能是年初的產(chǎn)仔事實可能會影響下一個年度的激素表現(xiàn)水平。李春等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小熊貓(Ailurusfulgens)在交配后的孕酮濃度維持在高水平，而雌二醇濃度維持在低水平。在本試驗中，參配黑熊的孕酮含量波動較大，孕酮含量峰值均在20 ng/mL以上，而雌二醇含量較低，這可能是因為高水平的孕酮濃度不僅可使雌性保持性冷淡，有利于胚胎的穩(wěn)固、減少流產(chǎn)，而且還可維持子宮黏膜增生、刺激子宮腺增長、彎曲增多、分泌加強，有利于維持妊娠[8]。由于黑熊的受精卵有延遲著床現(xiàn)象，只有受精卵著床之后，檢測孕酮含量才能對是否妊娠起指導作用。在本試驗中，我們發(fā)現(xiàn)參配母熊0204、06、74的孕酮在11月15日檢測含量最高，均高于10 ng/mL，0204、74的孕酮含量均隨之下降，而06的孕酮含量波動較大；未參配的黑熊孕酮含量均在10 ng/mL以下。3頭黑熊的產(chǎn)仔結(jié)果進一步證實在11月檢測到高水平的孕酮含量(高于10 ng/mL)，能夠?qū)θ焉锝Y(jié)果進行提示。

對3頭參配母熊的孕酮變化曲線進行分析，發(fā)現(xiàn)0204與06、74曲線變化差異較大，但是基于3頭母熊的飼養(yǎng)條件均相同，可排除飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)條件這部分外因。根據(jù)配種記錄，發(fā)現(xiàn)0204的配種產(chǎn)仔時間與74幾乎一致，但0204的年齡為14歲，74的年齡為12歲，究竟是何種原因造成這種差異，還有待分析。

上述結(jié)論對診斷圈養(yǎng)黑熊妊娠工作提供一定的參考，為圈養(yǎng)黑熊繁育研究提供一定研究數(shù)據(jù)。但受圈養(yǎng)黑熊數(shù)量、年齡、生理狀況及試驗方法等多種因素的影響，因此試驗結(jié)果僅供參考，還有待于進一步細化研究方案、擴大數(shù)量。

[1] 鄭星道，尹云厚，吳延春，等.應用超聲多普勒檢測儀、妊娠診斷盒對母熊早期懷孕診斷的試驗研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1996(2)：31-33.

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[3] 鄭紅華，尹云厚，鄭星道，等.應用超聲檢測儀及人用妊娠診斷盒對母熊早期妊娠診斷試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2004，40(2)：21-22.

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[8] 王建辰，章孝榮.動物生殖調(diào)控[M].合肥：安徽科學技術出版社，1998.

Captive black bear；Progesterone；ELISA；Pregnancy

Changes of Progesterone Content in Urine of Captive Black Bears During Middle and Late Pregnancy

Zheng Chengli Liu Taixiu*Zhou Lei Wang Xiaoyun

(Sichuan Institute of Musk Deer Breeding，Chengdu，611845，China)

We measured change in the content of progesterone in the urine of 6 captive female black bears from Sichuan Musk Deer Breeding Institute by Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)for over two months from 11 October to 13 December 2016.In the experimental group(3 breeding females)，the highest content of progesterone was 39.54 ng/mL，the lowest was 2.45 ng/mL.The content of progesterone was above 10 ng/mL in November.In the control group(3 female bile bears)，the highest content of progesterone was 32.62 ng/mL，the minimum value was 0.05 ng/mL，and the progesterone content was below 10 ng/mL during November and December.Progesterone content in the experimental group fluctuated regularly with one or two peak of progesterone.In the control group，there was no change in the progesterone content with the unmated bile bear progesterone and the progesterone value was significantly lower than that of experimental group.The experimental group all successfully reproduced，which indicated the changes of progesterone content in pregnant captive black bear urine can reflect the development of the placenta during pregnancy.This result could guide further study in the use of progesterone content as an index of pregnancy in captive black bears.

2017-03-20

修回日期：2017-04-11

發(fā)表日期：2017-11-10

S865.3+1 S814.1

A

2310-1490(2017)04-565-04

四川省應用基礎計劃項目(15JC0033)

鄭程莉，女，31歲，實習研究員，碩士；主要從事動物繁殖研究。E-mail：626771329@qq.com

*通訊作者：劉太秀，E-mail：fexiak@163.com