鄭程莉 劉太秀周 磊 汪曉鄆

(四川養(yǎng)麝研究所，成都，611845)稿件運(yùn)行過程

圈養(yǎng)黑熊妊娠中后期尿液中孕酮含量變化研究

鄭程莉 劉太秀1周 磊 汪曉鄆

(四川養(yǎng)麝研究所，成都，611845)稿件運(yùn)行過程

圈養(yǎng)黑熊；孕酮；酶聯(lián)免疫技術(shù)；妊娠期

為研究圈養(yǎng)雌性黑熊(Ursusthibetanus)妊娠中后期尿液中孕酮含量變化規(guī)律，試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫技術(shù)，2016年10月11日開始，至12月13日止，連續(xù)2個(gè)月測(cè)定四川養(yǎng)麝研究所黑熊養(yǎng)殖試驗(yàn)場6頭圈養(yǎng)母熊妊娠中后期孕酮的含量變化。試驗(yàn)結(jié)果表明：(1)試驗(yàn)組3頭圈養(yǎng)繁殖母熊孕酮含量最高值為39.54 ng/mL，最低值2.45 ng/mL，其中孕酮含量測(cè)定值在11月可達(dá)10 ng/mL以上；對(duì)照組3頭取膽母熊，孕酮含量最高值32.62 ng/mL，最低值0.05 ng/mL，其孕酮含量在11月和12月均在10 ng/mL以下；(2)試驗(yàn)組3頭母熊尿液中孕酮含量呈現(xiàn)有規(guī)律的波動(dòng)式變化，且3頭配種母熊孕酮有1～2個(gè)峰值；對(duì)照組3頭未配種取膽母熊孕酮值呈無規(guī)律性變化，其孕酮值顯著低于試驗(yàn)組。研究表明：試驗(yàn)組3頭母熊均順利產(chǎn)仔，配種圈養(yǎng)黑熊尿液孕酮含量變化能反映其妊娠期間胎盤發(fā)育情況，通過測(cè)定圈養(yǎng)黑熊孕酮含量的變化規(guī)律對(duì)判斷圈養(yǎng)黑熊妊娠將起到指導(dǎo)作用。

由于黑熊(Ursusthibetanus)是國家Ⅱ級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物，馴化程度不夠，人不易接近。黑熊在配種后，受精卵并不是立即著床發(fā)育，而是在子宮內(nèi)游離一段時(shí)間后，在11月底或12月初開始著床，胎兒發(fā)育在最后6～8周內(nèi)完成，產(chǎn)仔多在翌年的1～2月[1]。母熊的腹圍在臨產(chǎn)前1個(gè)月左右才有增大，但不甚明顯，尤其在圈養(yǎng)條件下，難以判斷其妊娠與否。因黑熊在冬季妊娠，并且有冬眠現(xiàn)象，有時(shí)會(huì)因人為疏忽導(dǎo)致其產(chǎn)仔未能及時(shí)得到護(hù)理，造成新生幼熊死亡。為了提高新生幼熊成活率，預(yù)測(cè)母熊妊娠時(shí)間，顯得尤為重要。

目前，有關(guān)黑熊早期妊娠診斷的研究報(bào)道為數(shù)不多，文泓淳等[2]最早采用多普勒法和激素對(duì)抗法對(duì)疑似妊娠而拖延取膽汁手術(shù)的3例雌黑熊進(jìn)行了妊娠診斷，結(jié)果可對(duì)未妊娠個(gè)體進(jìn)行診斷，但是對(duì)妊娠黑熊的診斷效果尚不清楚。鄭紅華等[3]采用人用妊娠診斷盒制劑和MCD-I型檢測(cè)儀對(duì)母熊進(jìn)行早期妊娠診斷，準(zhǔn)確率較高，但是亦對(duì)檢測(cè)時(shí)間和固定方法要求較高。金花子等[4]采用放射免疫測(cè)定法(RIA)進(jìn)行了圈養(yǎng)黑熊妊娠診斷初步研究，發(fā)現(xiàn)以妊娠著床期血清孕酮含量大于或等于4.38 ng/mL作為雌性黑熊妊娠依據(jù)。由于黑熊屬于兇猛動(dòng)物，必須要對(duì)其進(jìn)行麻醉，才能獲得血清，但是麻醉藥物會(huì)對(duì)妊娠黑熊胎兒造成影響，這種預(yù)測(cè)方法不能推廣應(yīng)用。

1993年，郭偉等[5]首次采用定性酶標(biāo)藥盒較準(zhǔn)確地測(cè)出了大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)交配后尿中PCG，從而確定大熊貓是否受孕。之前，我們已采用酶聯(lián)免疫技術(shù)對(duì)圈養(yǎng)黑熊發(fā)情周期尿液中雌二醇、孕酮含量變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)雌二醇是啟動(dòng)圈養(yǎng)黑熊繁殖發(fā)情的重要因素[6]。為了能對(duì)黑熊進(jìn)行早期妊娠診斷，本試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定圈養(yǎng)黑熊尿液中妊娠中后期孕酮變化情況，以期準(zhǔn)確判斷配種圈養(yǎng)黑熊妊娠與否。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

根據(jù)雌性黑熊的繁殖特點(diǎn)，選擇5～16歲，身體健康，發(fā)育健全，繁殖機(jī)能正常的雌性黑熊6頭，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，其中試驗(yàn)組3頭為繁殖母熊，編號(hào)分別為0204、06、74，3頭圈養(yǎng)黑熊均為2016年產(chǎn)過幼仔的繁殖母熊，已參與2016年配種計(jì)劃；對(duì)照組3頭為取膽母熊，編號(hào)分別為0511、9914、0307，未參與2016年配種計(jì)劃，但0511、0307分別于上一年度參與配種計(jì)劃，并于2016年2月產(chǎn)仔，均由四川養(yǎng)麝研究所養(yǎng)熊場提供。

1.2 尿樣收集

為排除性激素水平日常波動(dòng)的干擾，只取早晨新鮮尿液，取樣時(shí)間從2016年10月13日持續(xù)到12月13日，共計(jì)取樣10次。每周二早晨收集黑熊第1次晨尿10 mL，以3 000 r/min離心15 min，然后取上清液，置-20℃保存待用。

1.3 檢測(cè)試劑

雌二醇/孕酮酶聯(lián)免疫法定量試劑盒，購自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.4 主要儀器

酶標(biāo)分析儀(工作波長為450 nm)，由安圖實(shí)驗(yàn)儀器(鄭州)有限公司生產(chǎn)，儀器型號(hào)為PHOMO.。

2 方法

激素測(cè)定采用酶聯(lián)免疫競爭法測(cè)定尿液中雌二醇、孕酮含量[6]。所有的數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)間的差異顯著性釆用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件的單樣本t檢驗(yàn)分析得出。利用Excel繪制測(cè)定圈養(yǎng)黑熊妊娠期的激素變化趨勢(shì)圖并進(jìn)行分析比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 圈養(yǎng)黑熊雌二醇、孕酮含量的分析

通過測(cè)定6只圈養(yǎng)黑熊10～12月之間尿液中雌二醇、孕酮含量變化，發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)參配母熊的雌二醇的含量基本一致，孕酮的含量呈現(xiàn)一定的規(guī)律。在妊娠中后期，3頭試驗(yàn)配種母熊、3頭對(duì)照組取膽母熊雌二醇和孕酮的基本情況見表1。

表1 妊娠期圈養(yǎng)參配黑熊雌二醇和孕酮含量基本情況

Tab.1 The content of estradiol and progesterone in captive black bear

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無肩標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)

Note：The capital letter with column data showed very significant difference(P<0.01)，no capital letter showed no significant difference(P>0.05)

從表1所列的結(jié)果可以看出，6頭黑熊的雌二醇含量差異不顯著；編號(hào)為06、74、9914母熊的孕酮含量在整個(gè)測(cè)定周期內(nèi)差異極顯著(P<0.01)，呈現(xiàn)2～3個(gè)峰值，波動(dòng)較大，06、74孕酮含量均值高，而9914孕酮含量均值最低。

3.2 0204號(hào)繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化

從圖1可以看出，0204號(hào)圈養(yǎng)黑熊孕酮檢測(cè)值在第1次(10月11日)出現(xiàn)最高39.54 ng/mL，隨后逐漸下降趨勢(shì)，但是在第6次采樣時(shí)(11月15日)，孕酮的值出現(xiàn)升高(17.61 ng/mL)，但隨之降低，整個(gè)檢測(cè)期中呈現(xiàn)波浪式變化規(guī)律。

圖1 0204號(hào)繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的變化Fig.1 The changes of progesterone in the number 0204 of femalereproductive bear during the middle and late pregnancy

3.3 06號(hào)繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化

從圖2可以看出，06號(hào)孕酮變化曲線呈現(xiàn)“山”字形，孕酮第1個(gè)波峰的值為17.08 ng/mL，但是孕酮的最高值出現(xiàn)在第6次采樣時(shí)間段(11月15日)，其值為26.39 ng/mL，在最后12月13日檢測(cè)值較其他5頭母熊高出許多，達(dá)23.09 ng/mL。

3.4 74號(hào)繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化

從圖3可以看出，74號(hào)的孕酮變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律變化，檢測(cè)期間孕酮值在較高水平上變化，孕酮共出現(xiàn)3個(gè)高值，孕酮的最高含量為31.90 ng/mL，孕酮的最低含量為5.99 ng/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他5頭。

圖2 06號(hào)繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的變化Fig.2 The changes of progesterone in the number 06 of female reproductive bear during the middle and late pregnancy

圖3 74號(hào)繁殖母熊孕酮在妊娠中后期內(nèi)的變化Fig.3 The changes of progesterone in the number 74 of femalereproductive bear during the middle and late pregnancy

3.5 0511號(hào)取膽母熊尿液中孕酮的動(dòng)態(tài)變化

從圖4可以看出，0511號(hào)孕酮值在第3次檢測(cè)出現(xiàn)峰值(10月25日)28.05 ng/mL隨后逐漸降低，在最后一次采樣(12月13日)出現(xiàn)最低值。

圖4 0511號(hào)取膽母熊尿液中孕酮含量的變化Fig.4 The changes of progesterone content in the number 0511 of urine female bear

3.6 0307號(hào)取膽母熊尿液中孕酮的動(dòng)態(tài)變化

從圖5可以看出，0307號(hào)孕酮檢測(cè)值在第1次(10月11日)出現(xiàn)孕酮的最高含量為32.62 ng/mL，隨后逐漸降低，在最后一次采樣出現(xiàn)孕酮的最低含量值為1.62 ng/mL。

3.7 9914號(hào)取膽母熊尿液中孕酮的動(dòng)態(tài)變化

從圖6可以看出，9914號(hào)的孕酮值都較低水平上呈波浪式變動(dòng)，最高值僅為2.73 ng/mL，在最后一次采樣時(shí)又出現(xiàn)降低，孕酮的最低含量為0.45 ng/mL，為同一個(gè)波谷。

圖5 0307號(hào)取膽母熊尿液中孕酮含量的變化Fig.5 The changes of progesterone content in the number 0307 of urine female bear

圖6 9914號(hào)取膽母熊尿液中孕酮含量的變化Fig.6 The changes of progesterone content in the number 9914 of female bear urine

3.8 產(chǎn)仔情況統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)組的3頭黑熊，0204、74、06分別于2017年1月13日、1月13日和2月13日產(chǎn)仔，均為雙胎；而對(duì)照組的3頭黑熊均未產(chǎn)仔。

與孕酮檢測(cè)值結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)在11月之后，孕酮測(cè)量值高于10 ng/mL的個(gè)體，能夠產(chǎn)仔；在10月檢出的高孕酮含量，不能對(duì)圈養(yǎng)黑熊是否產(chǎn)仔起指導(dǎo)作用。

4 討論

為了對(duì)黑熊進(jìn)行早期妊娠診斷，本試驗(yàn)應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定了妊娠期圈養(yǎng)黑熊的雌二醇和孕酮含量。在本試驗(yàn)中，雌二醇含量基本維持在300 pg/mL左右，且變化幅度不大，而前期的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)情期雌二醇的峰值含量為1 000 pg/mL左右[6]，對(duì)比顯示妊娠期雌二醇含量基本維持在較低水平，進(jìn)一步證實(shí)了雌二醇對(duì)圈養(yǎng)黑熊繁殖發(fā)情非常重要。

對(duì)6頭黑熊妊娠中后期孕酮含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)0511和0307的孕酮含量在檢測(cè)初期最高，隨后整個(gè)下降趨勢(shì)明顯，而9914的孕酮含量一直維持在較低水平，這與黑熊的未妊娠表現(xiàn)相一致。根據(jù)資料顯示，9914未曾配種產(chǎn)仔，而0511、0307于2016年2月產(chǎn)仔，分析原因可能是年初的產(chǎn)仔事實(shí)可能會(huì)影響下一個(gè)年度的激素表現(xiàn)水平。李春等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小熊貓(Ailurusfulgens)在交配后的孕酮濃度維持在高水平，而雌二醇濃度維持在低水平。在本試驗(yàn)中，參配黑熊的孕酮含量波動(dòng)較大，孕酮含量峰值均在20 ng/mL以上，而雌二醇含量較低，這可能是因?yàn)楦咚降脑型獫舛炔粌H可使雌性保持性冷淡，有利于胚胎的穩(wěn)固、減少流產(chǎn)，而且還可維持子宮黏膜增生、刺激子宮腺增長、彎曲增多、分泌加強(qiáng)，有利于維持妊娠[8]。由于黑熊的受精卵有延遲著床現(xiàn)象，只有受精卵著床之后，檢測(cè)孕酮含量才能對(duì)是否妊娠起指導(dǎo)作用。在本試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)參配母熊0204、06、74的孕酮在11月15日檢測(cè)含量最高，均高于10 ng/mL，0204、74的孕酮含量均隨之下降，而06的孕酮含量波動(dòng)較大；未參配的黑熊孕酮含量均在10 ng/mL以下。3頭黑熊的產(chǎn)仔結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在11月檢測(cè)到高水平的孕酮含量(高于10 ng/mL)，能夠?qū)θ焉锝Y(jié)果進(jìn)行提示。

對(duì)3頭參配母熊的孕酮變化曲線進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)0204與06、74曲線變化差異較大，但是基于3頭母熊的飼養(yǎng)條件均相同，可排除飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)條件這部分外因。根據(jù)配種記錄，發(fā)現(xiàn)0204的配種產(chǎn)仔時(shí)間與74幾乎一致，但0204的年齡為14歲，74的年齡為12歲，究竟是何種原因造成這種差異，還有待分析。

上述結(jié)論對(duì)診斷圈養(yǎng)黑熊妊娠工作提供一定的參考，為圈養(yǎng)黑熊繁育研究提供一定研究數(shù)據(jù)。但受圈養(yǎng)黑熊數(shù)量、年齡、生理狀況及試驗(yàn)方法等多種因素的影響，因此試驗(yàn)結(jié)果僅供參考，還有待于進(jìn)一步細(xì)化研究方案、擴(kuò)大數(shù)量。

[1] 鄭星道，尹云厚，吳延春，等.應(yīng)用超聲多普勒檢測(cè)儀、妊娠診斷盒對(duì)母熊早期懷孕診斷的試驗(yàn)研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1996(2)：31-33.

[2] 文泓淳，李炳權(quán)，李文學(xué)，等.用多普勒法和激素對(duì)抗法對(duì)黑熊進(jìn)行妊娠診斷[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1991(1)：37.

[3] 鄭紅華，尹云厚，鄭星道，等.應(yīng)用超聲檢測(cè)儀及人用妊娠診斷盒對(duì)母熊早期妊娠診斷試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2004，40(2)：21-22.

[4] 金花子，金杰，李繼鵬，等.放射免疫測(cè)定法(RIA)應(yīng)用于圈養(yǎng)黑熊妊娠診斷的初探[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014(6)：99-100.

[5] 郭偉，朱本仁.應(yīng)用定性酶標(biāo)法測(cè)定大熊貓妊娠試驗(yàn)初報(bào)[J].四川動(dòng)物，1993，12(4)：36-37.

[6] 鄭程莉，劉太秀，汪曉鄆，等.圈養(yǎng)黑熊發(fā)情周期尿液雌二醇、孕酮含量變化研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016(15)：213-215，219.

[7] 李春，魏輔文，胡錦矗.雌性小熊貓糞樣中雌二醇與孕酮水平的變化與繁殖啟動(dòng)的關(guān)系[J].動(dòng)物學(xué)研究，2005，26(2)：147-151.

[8] 王建辰，章孝榮.動(dòng)物生殖調(diào)控[M].合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

Captive black bear；Progesterone；ELISA；Pregnancy

Changes of Progesterone Content in Urine of Captive Black Bears During Middle and Late Pregnancy

Zheng Chengli Liu Taixiu*Zhou Lei Wang Xiaoyun

(Sichuan Institute of Musk Deer Breeding，Chengdu，611845，China)

We measured change in the content of progesterone in the urine of 6 captive female black bears from Sichuan Musk Deer Breeding Institute by Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)for over two months from 11 October to 13 December 2016.In the experimental group(3 breeding females)，the highest content of progesterone was 39.54 ng/mL，the lowest was 2.45 ng/mL.The content of progesterone was above 10 ng/mL in November.In the control group(3 female bile bears)，the highest content of progesterone was 32.62 ng/mL，the minimum value was 0.05 ng/mL，and the progesterone content was below 10 ng/mL during November and December.Progesterone content in the experimental group fluctuated regularly with one or two peak of progesterone.In the control group，there was no change in the progesterone content with the unmated bile bear progesterone and the progesterone value was significantly lower than that of experimental group.The experimental group all successfully reproduced，which indicated the changes of progesterone content in pregnant captive black bear urine can reflect the development of the placenta during pregnancy.This result could guide further study in the use of progesterone content as an index of pregnancy in captive black bears.

2017-03-20

修回日期：2017-04-11

發(fā)表日期：2017-11-10

S865.3+1 S814.1

A

2310-1490(2017)04-565-04

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目(15JC0033)

鄭程莉，女，31歲，實(shí)習(xí)研究員，碩士；主要從事動(dòng)物繁殖研究。E-mail：626771329@qq.com

*通訊作者：劉太秀，E-mail：fexiak@163.com