費(fèi)諾亞，李 媛，石凌波，孟婷婷，傅俊范，嚴(yán)雪瑞

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

藍(lán)莓帚梗柱孢枝枯病病原菌鑒定及生物學(xué)特性

費(fèi)諾亞，李 媛，石凌波，孟婷婷，傅俊范，嚴(yán)雪瑞*

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

【目的】2015年6月在來(lái)自湖北隨州的藍(lán)莓苗木中，發(fā)現(xiàn)一種由帚梗柱孢霉引起的枝枯病。本研究開(kāi)展了致病菌的鑒定工作，為病害的防治提供指導(dǎo)?！痉椒ā坎臃蛛x物通過(guò)組織分離、單孢分離及純化后，用柯赫氏法則進(jìn)行了致病性測(cè)定。致病菌的鑒定采用形態(tài)學(xué)、ITS序列比對(duì)及基于EF-1α，β-tubulin和Histone 3三段基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的聯(lián)合確定，同時(shí)本研究對(duì)病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定?！窘Y(jié)果】通過(guò)分離及致病菌測(cè)定后，選取代表菌株HBSZ05Ba進(jìn)一步研究。形態(tài)學(xué)特征及ITS比對(duì)結(jié)果均將代表菌株劃分入帚梗柱孢霉屬球狀囊泡組，三段基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，該病害的病原菌為Cylindrocladiumcanadense(有性態(tài)為Calonectriacanadensis)。生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果表明：菌絲生長(zhǎng)最適溫度為25 ℃，最適培養(yǎng)基為PDA，光照對(duì)菌落生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，最適氮源為NaNO3，最適碳源為可溶性淀粉?！窘Y(jié)論】湖北隨州藍(lán)莓枝枯病病原菌經(jīng)鑒定為C．canadense，該種真菌在藍(lán)莓上的為害屬首次報(bào)道。

藍(lán)莓；枝枯??；鑒定；生物學(xué)特性

【研究意義】藍(lán)莓 (英文Blueberry)，世界范圍的一種新興小漿果樹(shù)種，指原產(chǎn)北美地區(qū)的杜鵑花科 (Ericaceae) 越橘屬 (Vaccinium) 中藍(lán)果類型植物。根據(jù)吳林研究顯示[1]，至2015年在全國(guó)超過(guò)20個(gè)省市區(qū)開(kāi)展了藍(lán)莓種植，總面積約3×108m2，產(chǎn)量達(dá)2.5×107kg。隨著種植面積與產(chǎn)量的逐年上升，病害的種類也逐年增大，尤其是枝枯類病害對(duì)藍(lán)莓品質(zhì)造成的影響不容忽視?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】麗赤殼屬真菌(Calonectria) 和其無(wú)性態(tài)帚梗柱孢霉屬 (Cylindrocladium) 是在全世界范圍廣泛分布的重要植物病原真菌，尤其是在亞熱帶和熱帶地區(qū)，寄主范圍廣，存在于土壤或植物病殘?bào)w中，引起多種植物病害，如根腐病、猝倒病等[2]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2015年在一批來(lái)自湖北隨州的藍(lán)莓苗木中，在品種‘埃利奧特’的植株上，發(fā)現(xiàn)一種帚梗柱孢霉引起的枝枯病，其癥狀是莖部出現(xiàn)表皮干枯，并伴有開(kāi)裂，干枯部可環(huán)繞枝條?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為鑒定該病害的病原，本文對(duì)病原菌進(jìn)行了分離純化與鑒定，并對(duì)該病原菌生物學(xué)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離純化

分離：采用常規(guī)的組織分離法[3]，取具有典型癥狀病害樣品的病健交界處切塊并進(jìn)行表面消毒后置于PDA平板 (d=90 mm) ，25 ℃條件下培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，統(tǒng)計(jì)分離頻率。

純化：將分離得到的菌株轉(zhuǎn)至SNA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)[4]，產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢分離純化，以無(wú)菌水洗脫分生孢子制成懸浮液。吸取孢懸液0.1 mL至4 % WA平板上，使用滅菌的L型涂布器將孢懸液均勻涂布于平板表面，靜置10 min。將WA平板切成0.4 cm×0.4 cm的小塊，逐個(gè)鏡檢，選擇載有單個(gè)孢子的瓊脂塊移至PDA上培養(yǎng)。

保存：將純化后的菌株轉(zhuǎn)至PDA斜面上，4 ℃保存。

1.2 病原菌致病性測(cè)定

采用活體傷口接種法，挑選健康的兩年生‘埃利奧特’品種藍(lán)莓植株，無(wú)菌水洗凈并用酒精棉消毒后，用滅菌刀片在植株枝條上造成輕微傷口，將供試菌株HBSZ05Ba在PDA上活化3 d后，使用滅菌打孔器于菌落邊緣處打取菌餅 (d=5 mm) 貼在滅菌脫脂棉上，將脫脂棉分別貼靠在枝條的傷口上，使菌絲與傷口充分接觸，纏繞保鮮膜固定保濕，3次重復(fù)，對(duì)照試驗(yàn)中將菌餅替換為無(wú)菌PDA塊。25 ℃條件下48 h后摘掉脫脂棉并觀察發(fā)病情況，持續(xù)噴水保濕，5 d后再次觀察結(jié)果并記錄。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 參照Crous[5]的研究，對(duì)病原菌的形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，觀察在25 ℃、SNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d時(shí)的分生孢子形態(tài)與囊泡形狀等。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 病原菌DNA提?。汗┰嚲昊罨囵B(yǎng)3 d后，打菌餅 (d=5 mm) 接種到PD液體培養(yǎng)基中，室溫條件下使用回旋振蕩器 (130 r/min) 培養(yǎng)5 d后收集菌絲，菌絲體冷凍干燥備用?；蚪MDNA提取采用CTAB法，并置于-20 ℃冰箱中保存待用。

ITS序列擴(kuò)增及比對(duì)：使用引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

EF-1α，β-tubulin及Histone 3擴(kuò)增與系統(tǒng)發(fā)育分析：引物序列見(jiàn)表1。挑選出與目標(biāo)菌株序列相近的已知種及帚梗柱孢霉屬球形囊泡組的模式菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，參考菌株相關(guān)信息見(jiàn)表2。用軟件ClustalX2.1對(duì)所有序列進(jìn)行對(duì)位排列 (alignment)；使用軟件MEGA7對(duì)EF1-α，β-tubulin及Histone 3[6]聯(lián)合基因采用最大似然法 (ML) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以C．colhounii作為外群。

1.4 病原菌生物學(xué)特性

對(duì)病原菌在不同條件下的菌絲生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定，以全光照、全黑暗、12 h光暗交替作為不同光照條件；不同溫度條件選擇5、10、15、20、25、30、35 ℃。將病原菌接種在PDA上，并于不同光照、溫度條件下培養(yǎng)。以查氏培養(yǎng)基作為不同碳源與氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不同碳源選擇與查氏中蔗糖等量的葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖；不同氮源選擇與查氏中NaNO3等量的半胱氨酸、甘氨酸、NH4H2PO4、(NH4)2SO4。將活化3 d的病原菌接種至上述不同氮源、碳源培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)條件。上述每個(gè)處理重復(fù)3次，分別在3，5，7 d測(cè)量平板上菌落直徑。數(shù)據(jù)通過(guò)Excel求取平均值等。

表1 使用引物及序列

表2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的參考菌株相關(guān)信息

2 結(jié)果與分析

2.1 病樣采集與病原菌分離純化

帚梗柱孢霉枝枯病的癥狀是莖部出現(xiàn)表皮干枯，并伴有開(kāi)裂，干枯部可環(huán)繞枝條，后期致整枝枯死，剖開(kāi)發(fā)病莖部可見(jiàn)維管束未受害 (圖1，A)。

經(jīng)組織分離與單孢分離，得到了一株真菌編號(hào)為HBSZ05Ba，25 ℃條件下其菌落在PDA培養(yǎng)基上初期菌落白色圓形，邊緣整齊，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，絨毛狀，7 d左右可生長(zhǎng)至90 mm (圖1，H)，分離頻率為75 %。

2.2 病原菌致病性測(cè)定

健康的藍(lán)莓植株活體枝條在接種HBSZ05Ba后48 h揭去菌絲塊時(shí)，即可觀察到明顯的發(fā)病情況，病斑平均長(zhǎng)度達(dá)1 cm，接種5 d時(shí)觀察病斑擴(kuò)展至5 cm，而空白對(duì)照組枝條未發(fā)病 (圖1，B，C，D)。從接種發(fā)病的部位可重新分離到與接種菌相同的菌株，而對(duì)照組植株不發(fā)病，證明所分離接種的菌株為造成藍(lán)莓枝枯病的病原菌。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 分離得到的菌株HBSZ05Ba，分生孢子無(wú)色，直圓柱型，兩端鈍圓，無(wú)隔膜或具1個(gè)隔膜，分隔處不具明顯可見(jiàn)的縊痕 (圖1，G)，大小為 (45.0～68.1) × (3.2～5.4) μm，平均62.9 × 4.5 μm。分生孢子梗末端囊泡梨形至球狀，直徑5～11 μm (圖1，E)。在SNA培養(yǎng)基上無(wú)超大孢子、小孢子或小型子囊殼形成。PDA培養(yǎng)7 d時(shí)菌落開(kāi)始產(chǎn)生厚垣孢子，呈紅褐色 (圖1，F(xiàn))。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 經(jīng)檢測(cè)，所提取的DNA濃度為51 ng/μl。將測(cè)序得到的菌株ITS，EF1-α，β-tubulin及Histone 3序列提交到NCBI/GenBank獲得的基因登錄號(hào)(ITS-KY984067，EF1-α-KY978481，β-tubulin-KY978482，Histone 3-KY978483)，ITS序列在NCBI中的BLAST結(jié)果表明，供試菌株的ITS序列與C.canadensis的同源性達(dá)100 %。將供試菌株的EF1-α，β-tubulin及Histone 3基因序列與文獻(xiàn)中的模式菌株在NCBI上下載的模式菌株的序列進(jìn)行聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果與UFV 76以及CBS 110817 (C.canadensis) 聚在同一分支 (圖2)。

A．原始發(fā)病癥狀；B．致病性測(cè)定5 d時(shí)；C．5 d時(shí)的對(duì)照組；D.接種5 d時(shí)的處理組；E．分生孢子梗末端囊泡 (SNA培養(yǎng)基)，標(biāo)尺=2 μm；F．厚垣孢子 (PDA培養(yǎng)基)，標(biāo)尺= 20 μm；G．分生孢子形態(tài) (SNA培養(yǎng)基)，標(biāo)尺=50 μmA．Natural symptoms of stem blight on blueberry；B．Pathogenicity tests after 5 d；C．CK in pathogenicity tests after 5 d；D.Symptoms of inoculated blueberry after 5 d；E．Sphaeropedunculate vesicle，bar=2 μm；F．Chlamydospores on PDA，bar=20 μm；G．Macroconidium on SNA，bar=50 μm圖1 HBSZ05Ba所致癥狀及菌株形態(tài)Fig.1 Symptoms on blueberry caused by Cylindrocladium canadense and morphology of the fungal isolate HBSZ05Ba

采取最大似然法 (ML) 基于Kimura 2-parameter模型進(jìn)行分析，使用軟件MEGA7 建立EF-1α，β-tubulin及Histone 3三段基因聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。以Calonectria colhounii為外群，HBSZ05Ba與 Calonectria canadensis(anamorph Cylindrocladium canadense)聚為一支，Bootstrap值=100%Maximum likelihood method tree based on the Kimura 2-parameter model generated from the combined EF-1α，β-tubulin and Histone 3 genes by MEGA 7．The tree is rooted with Calonectria colhounii，the isolate HBSZ05Ba belongs to Calonectria canadensis(anamorph Cylindrocladium canadense)．Bootstrap values=100%圖2 基于EF1-α，β-tubulin及Histone 3三段基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on combined EF1-α，β-tubulin and Histone 3 gene

2.4 病原菌生物學(xué)特性

主要的生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果表明：菌絲生長(zhǎng)最適溫度為25 ℃不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響明顯，5與35 ℃條件下菌絲不能生長(zhǎng) (圖1，H)；選取的幾種培養(yǎng)基中，在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快；不同光照條件對(duì)菌落生長(zhǎng)無(wú)明顯影響；最適氮源為NaNO3，最適碳源為可溶性淀粉。

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)已報(bào)道的藍(lán)莓枝枯病原主要有葡萄座腔菌 (Botryosphaeriadothidea)[9]、小新殼梭孢 (Neofusicoccumparvum)[9]、棒狀擬盤(pán)多毛孢 (Pestalotiopsisclavispora)[10]、新擬盤(pán)多毛孢 (Neopestalotiopsischrysea)[11]、烏飯樹(shù)擬莖點(diǎn)霉 (Phomopsisvaccinii)[12]、間座殼潰瘍病菌 (Diaporthephaseolorum)[13]、尖孢炭疽菌 (Colletotrichumacutatum)[14]、膠孢炭疽菌 (C．Gloeosporioides)[14]，可可毛色二孢 (Lasiodiplodiatheobromae)[9]以及假可可毛色二孢 (L．pseudotheobromae)[15]，且不斷有新的藍(lán)莓枝枯病病原被鑒定出來(lái)。不同的病原菌在生物學(xué)特性方面可能存在差異，因此研究病原的生物學(xué)特性十分必要。

根據(jù)Crous的研究[5]，帚梗柱孢霉屬分類的重要特征是囊泡的形狀，然而球形囊泡與梨形或卵圓形易混淆[16]，因此還需進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定。Lombard等[7]對(duì)Calonectria屬的多個(gè)種進(jìn)行了ACT，BT，CAL，HIS3，ITS，LSU以及EF-1α共7段基因的多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，將該屬分為13個(gè)系統(tǒng)發(fā)育組 (group)，并根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果得出，未知的Calonectria屬菌株可通過(guò)EF-1α，β-tubulin及Histone 3 3段基因進(jìn)行鑒定。本次分離到的菌株HBSZ05Ba與曾經(jīng)在藍(lán)莓上報(bào)道的引起葉斑病的柯氏帚梗柱孢[8]在形態(tài)學(xué)、ITS序列上以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中均可以區(qū)分。

4 結(jié) 論

經(jīng)形態(tài)學(xué)與系統(tǒng)發(fā)育研究確定引起湖北隨州藍(lán)莓枝枯病的病原菌為C．canadense，這是該種真菌為害藍(lán)莓的首次報(bào)道，此為區(qū)別于的C．colhounii[8]又一帚梗柱孢霉屬新種群為害藍(lán)莓的報(bào)道。生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度與碳源氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響明顯，而光照條件無(wú)影響。

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IdentificationofCylindrocladiumPathogenofBlueberryStemBlightandBiologicalCharacteristicsTests

FEI Nuo-ya，LI Yuan，SHI Ling-bo，MENG Ting-ting，F(xiàn)U Jun-fan，YAN Xue-rui*

(College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Liaoning Shenyang 110866，China)

【Objective】A new kind of stem blight caused byCylindrocladiumwere found on blueberry from Hubei Suizhou．Several studies were conducted to identify the pathogen and provide theoretical foundation for the disease control．【Method】The pathogen of the disease was isolated and purified and pathogenicity was determined by Kochs postulate．The isolate from blueberry was identified based on morphology, BLAST of ITS and molecular phylogenetic combined TEF-1α，β-tubulin and Histone 3．The biological characteristics were studied．【Result】According to morphology and BLAST of ITS, the represenitive isolate HBSZ05Ba belongs toCylindrocladiumspp．of sphaeropedunculate vesicle. Phylogenetic tree showed that the isolate wasC．canadense(teleomorphCalonectriacanadensis)．The biological tests showed that 25 ℃，PDA was the best colony growth conditions．Different light conditions had no significant effect on the colony growth．The optimum carbon source is soluble starch and the optimum nitrogen source is NaNO3．【Conclusion】The pathogen of stem blight found on blueberry from Hubei Suizhou in June 2015 was identified asC．canadense．It is the first report that this fungus can cause stem blight on blueberry．

Blueberry; Stem blight;Identification; Biological characteristics

1001-4829(2017)10-2251-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.016

2017-04-27

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103037)；沈陽(yáng)市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(F15-167-4-00，F(xiàn)15-079-3-00)

費(fèi)諾亞(1994-)，碩士，主要研究植物病理學(xué)，E-mail：13478871952@163.com，*為通訊作者：嚴(yán)雪瑞，博士，教授，從事園藝植物病理學(xué)研究；E-mail：berrypest@126.com。

S435.661

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(責(zé)任編輯 李 潔)