虞哲高,趙小陽

(1.帝斯曼營養(yǎng)產(chǎn)品部中國研發(fā)中心,帝斯曼中國有限公司,上海 201203;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(北京),北京 100081)

分光光度法檢測飼料添加劑β-胡蘿卜素粉含量的研究

虞哲高1,趙小陽2*

(1.帝斯曼營養(yǎng)產(chǎn)品部中國研發(fā)中心,帝斯曼中國有限公司,上海 201203;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(北京),北京 100081)

依據(jù)β-胡蘿卜素異構(gòu)體的等吸收波長的特性,建立了用分光光度法測定飼料添加劑β-胡蘿卜素粉的測定方法.試樣經(jīng)酶解后,用乙醇和二氯甲烷提取,用環(huán)己烷稀釋后,在421.0 nm處測定.該方法的檢測結(jié)果與AOAC 2005.7液相色譜法測定的結(jié)果吻合;該方法在0.6~6 μg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性,線性回歸系數(shù)R2=0.999 8;樣品測試的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.52%.該方法具有快速、準(zhǔn)確、分析成本低等優(yōu)點.

分光光度法;等吸收波長;β-胡蘿卜素;飼料添加劑

β-胡蘿卜素是維生素A的前體,廣泛存在于綠色和黃色蔬菜、水果中,其分子結(jié)構(gòu)相當(dāng)于2個分子的維生素A,當(dāng)動物機體需要維生素A時,可及時轉(zhuǎn)化為維生素A,當(dāng)體內(nèi)維生素A的量足夠滿足體內(nèi)代謝需要時,β-胡蘿卜素會在體內(nèi)儲存起來,發(fā)揮其作用.除了具備維生素A的作用外,β-胡蘿卜素還能消除動物體內(nèi)有毒的氧自由基,提高動物自身免疫力,促進動物生長,提高生產(chǎn)性能,特別對母畜禽繁殖性能有明顯效果.此外,β-胡蘿卜素呈黃色至紅色,也是一種有效的著色劑.工業(yè)上,β-胡蘿卜素可通過化學(xué)合成和微生物發(fā)酵法制備.

飼料添加劑β-胡蘿卜素粉是以β-胡蘿卜素結(jié)晶為原料,并添加淀粉、明膠等輔料經(jīng)噴霧干燥制成的桔紅色至紅褐色微粒.在高溫條件下,部分反式β-胡蘿卜素會轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖溅?胡蘿卜素[1],在β-胡蘿卜素粉產(chǎn)品中,會有部分順式β-胡蘿卜素在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生.對于全反式的β-胡蘿卜素結(jié)晶,歐洲藥典(EP 9.2)、美國藥典(USP 2017)、英國藥典(BP 2017)均采用分光光度法、依據(jù)在環(huán)己烷溶液中全反式β-胡蘿卜素最大吸收波長處的百分吸光系數(shù)為2 500的特性,測定455 nm處最大吸光度來計算含量.由于反式β-胡蘿卜素和順式β-胡蘿卜素在455 nm處的百分吸光系數(shù)不同[2],測定全反式β-胡蘿卜素結(jié)晶的方法不能準(zhǔn)確地測定飼料添加劑β-胡蘿卜素粉的含量.AOAC 2005.7是用反相高效液相色譜法測定β-胡蘿卜素總量的方法,適用于飼料添加劑β-胡蘿卜素粉的測定.該方法具有專屬性高、準(zhǔn)確度好等優(yōu)點,但分析成本較高.

有研究表明[3],在環(huán)己烷溶劑中,β-胡蘿卜素順反式異構(gòu)體在421.0 nm波長處具有相同的百分吸光系數(shù).依據(jù)這一研究成果,本研究在421.0 nm的等吸收波長處用分光光度法檢測飼料添加劑β-胡蘿卜素粉含量,旨在建立適用于檢測飼料添加劑β-胡蘿卜素粉的分光光度分析方法.

1 試驗方法

1.1 試劑和溶液 無水乙醇、二氯甲烷、環(huán)己烷、2,6-二叔丁基對甲酚、堿性蛋白酶.

1.2 儀器設(shè)備 分析天平:感量為0.000 1g;超聲波振蕩提取器;離心機:4 000 r/min;紫外可見分光光度計;氧化鈥玻璃濾光片.

1.3 含量測定

1.3.1 原理 酶解法破膜后,用無水乙醇和二氯甲烷提取β-胡蘿卜素,用環(huán)己烷將β-胡蘿卜素稀釋至適當(dāng)濃度.試樣中的順反異構(gòu)體在421.0 nm處有相同的百分吸光系數(shù),在該等吸收波長處,用分光光度儀測定試樣溶液的吸光度,通過吸光度計算β-胡蘿卜素總量.

1.3.2 試液的制備 稱取的試樣約100 mg,精確至0.1 mg,置于250 mL棕色容量瓶中.再在容量瓶內(nèi)加入100 mg 2,6-二叔丁基對甲酚、200 mg堿性蛋白酶、10 mL蒸餾水,于50℃水浴中超聲30 min.加入100 mL無水乙醇、135 mL二氯甲烷,搖勻后繼續(xù)超聲處理5 min.待冷卻后用二氯甲烷稀釋至刻度,搖勻后取適量,以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min.準(zhǔn)確吸取上清液10 mL,置于100 mL棕色容量瓶中,加入5 mL無水乙醇,用環(huán)己烷溶解并稀釋至刻度,搖勻后即為待測溶液.

1.3.3 測定 紫外可見分光光度儀的波長精度要求準(zhǔn)確.在測定前,用氧化鈥玻璃濾光片對儀器的波長精度做校正,測定樣品的工作波長λw,λw根據(jù)公式λw=421.0+λf‐λt得出.氧化鈥在 360.9 nm 處有一吸收峰,式中λf為在紫外可見分光光度儀上測得氧化鈥濾光片在該吸收峰的波長值,λt為經(jīng)計量校正得到的氧化鈥濾光片在該吸收峰的波長值.

以環(huán)己烷為空白,用1 cm寬的比色皿測定待測溶液在工作波長λw的吸光值.

1.3.4 β-胡蘿卜素含量計算 計算公式:

式中, X1為β-胡蘿卜素含量,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示(%);A為試液的吸收值;W為試樣質(zhì)量(g);2 500為試液稀釋體積(mL);1 480為β-胡蘿卜素在工作波長λw處的百分吸光系數(shù).

1.3.5 方法的檢測限 用該法測定β-胡蘿卜素粉的最低檢測限為β-胡蘿卜素的含量為1%.

1.4 方法學(xué)驗證

1.4.1 驗證參數(shù)及驗收標(biāo)準(zhǔn) 以收集的飼料添加劑β-胡蘿卜素為試樣,進行方法學(xué)驗證.分析方法驗證所涉及的參數(shù)及其驗收標(biāo)準(zhǔn)見表1.

表1 驗證參數(shù)及驗收標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 線性范圍 在環(huán)己烷中,用全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度為0.6~6 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,濃度及其對應(yīng)于421.0 nm處吸光度關(guān)系曲線見圖1.結(jié)果顯示,在此濃度范圍內(nèi),濃度與吸光度值之間具有良好的線性范圍,線性回歸系數(shù)R2大于0.999.

圖1 線性范圍的測試

1.4.3 重現(xiàn)性 按照"1.3.2、1.3.3"規(guī)定的步驟,對同一批飼料添加劑β-胡蘿卜素粉測試6次,含量在10.02%~10.72%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%為2.52%,表明方法具有良好的重現(xiàn)性.

1.4.4 準(zhǔn)確度 用分光光度法方法(UV法)和AOAC 2005.7方法(HPLC法)分別測試了6家企業(yè)生產(chǎn)的飼料添加劑β-胡蘿卜素粉樣品.2種方法測得結(jié)果的相對偏差在5%以內(nèi)(表2).配對樣本t檢驗的統(tǒng)計顯示,2種方法的結(jié)果無顯著性差異.

表2 UV法和HPLC法測試結(jié)果的比較 %

1.4.5 穩(wěn)定性 考察樣品溶液酶解提取后β-胡蘿卜素在環(huán)己烷中的穩(wěn)定性.提取液經(jīng)環(huán)己烷稀釋后,立即按分光光度法測定等吸收波長421.0 nm處的吸光度,吸光度值以A0表示,以后每隔10 min測1次吸光度值.從表3可看出,樣品用環(huán)己烷稀釋后,在1 h內(nèi),樣品的吸光度穩(wěn)定.

表3 β-胡蘿卜素樣品溶液的穩(wěn)定性測試

1.4.6 驗證小結(jié) 用分光光度法測定飼料添加劑β-胡蘿卜素粉含量的驗證結(jié)果表明,所有驗證參數(shù)均能滿足驗收標(biāo)準(zhǔn)的要求,建立的分光光度法適用于飼料添加劑β-胡蘿卜素粉含量的測定.

2 結(jié) 果

AOAC 2005.7液相色譜法的檢測結(jié)果顯示,6家不同企業(yè)的β-胡蘿卜素粉產(chǎn)品中,均發(fā)現(xiàn)有部分順式異構(gòu)體存在.圖2是用液相色譜法測得的飼料添加劑β-胡蘿卜素粉的色譜圖.由于不同企業(yè)的生產(chǎn)工藝不同,產(chǎn)品中順反式異構(gòu)體的比例有所差異.順式異構(gòu)體是在噴霧干燥過程中由于溫度的影響而產(chǎn)生的.

圖2 全返式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

β-胡蘿卜素異構(gòu)體的百分吸光系數(shù)在最大吸收波長處存在差異.表4為在正己烷溶劑中,β-胡蘿卜素異構(gòu)體在最大吸收波長處的百分吸光系數(shù)值[2].飼料添加劑β-胡蘿卜素粉有順反式結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體,且順反異構(gòu)體的比例沒有一個固定值,在β-胡蘿卜素最大吸收波長處測定吸光值,無法得出準(zhǔn)確的結(jié)果.

表4 β-胡蘿卜素的百分吸光系數(shù)

對于文獻[3]報道的421.0 nm處的等吸收點波長,通過下述實驗予以確認.稱取約6 mg的全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品和0.5 g 2,6-二叔丁基對甲酚于100 mL容量瓶中,用四氫呋喃溶解并定容至刻度.精密吸取3.0 mL全反式β-胡蘿卜素溶液于有螺帽的小試管中,用高效液相色譜法和分光光度法考察不同溫度條件下溶液的情況.液相色譜的結(jié)果顯示,全反式β-胡蘿卜素溶液在密封的小試管內(nèi)于100℃條件下加熱2 h,β-胡蘿卜素的總量未發(fā)現(xiàn)有明顯下降.但溶液在加熱過程中,順反比例發(fā)生了變化.加熱時間越長,產(chǎn)生的順式異構(gòu)體的比例越高.將不同溫度條件下β-胡蘿卜素溶液在分光光度儀上于350~550 nm波長范圍內(nèi)掃描,光譜圖見圖3.由圖3可知,4個含量相同、順反式比例不同的β-胡蘿卜素溶液,在最大吸收波長處的吸收度是不同的,加熱的時間越長,即產(chǎn)生順式異構(gòu)體比例越高的溶液,在最大吸收波長處的吸光度越低.

圖3 β-胡蘿卜素在300~550 nm的光譜圖

圖4 β-胡蘿卜素在400~430 nm光譜圖

圖4為截取圖3的部分波長范圍的光譜圖.由圖4可以看出,盡管4個溶液的順反式β-胡蘿卜素的比例有差異,但在421.0 nm處吸光度幾乎相同.421.0 nm處的等吸收點波長處,順反式β-胡蘿卜素有相同的百分吸光系數(shù),在該波長處,β-胡蘿卜素的順反式比例的多少不影響吸光度值,在該點測定能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性.由于等吸收點波長處位于峰肩,分光光度儀波長的偏移會影響到測試結(jié)果的準(zhǔn)確度,要求在測定前,用氧化鈥濾光片對儀器的波長精度作校正.

3 結(jié) 論

本文建立了在β-胡蘿卜素的等吸收波長處測定吸光度的分光光度分析方法.該方法測定結(jié)果與AOAC2005.7用HPLC測定的結(jié)果一致.本方法具有分析成本低、簡便快速、準(zhǔn)確度高的特點,有較高的應(yīng)用價值.

[1] Marx M, Staparic M, Schieber A, et al. Effects of thermal processing on trans‐cis‐isomerization of β‐carotene in carrot juices and carotene containing preparations[J]. Food Chem, 2003, (83):609‐617.

[2] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會, 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. GB5009.83-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中胡蘿卜素的測定[S].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社.

[3] Schierle J, Schellenberger T, Fizet C , et all. A simple Spectrophotometric determination of total β‐carotene in food additives with varying E/Z‐isomer ratios using an isobetestic wavelength [J]. Eur Food Res Technol, 2002 ,215 (3) :268‐274 .

Determination of β-carotene in Feed Additive by Spectrophotometry

YU Zhe‐gao1, ZHAO Xiao‐yang2*

(1. DSM Nutritional Products China Research Center, DSM China Co. Ltd, Shanghai 201203,China;2. Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agricultural product, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081,China)

To establish a quantitative method to determination of β‐carotene in feed additive by spectrophotometry,based on isobestic wavelength of β‐carotene. β‐carotene powder is disclosed by enzymatic treatment and then extracted with dichloromethane and ethanol, followed by dilution with cyclohexane. The Absorbance is measured at a wavelength of 421.0 nm. The relative standard deviation is 2.52%, the results of this method is consistent with the results of AOAC 2005.7 method. The method has a good linearity in the range of 0.6~6 μg/mL with the correlation coefficient R2=0.999 8.This method is simple, reliable and economical.

Spectrophotometry; Isobestic wavelength; β‐carotene; Feed additive

S816;O657.7

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-113

2017-10-19;

2017-10-26

虞哲高(1965-),男,高級工程師,研究方向為食品 / 飼料領(lǐng)域應(yīng)用開發(fā),E‐mail‐Zhe‐Gao@dsm.com

* 通訊作者:趙小陽(1962-),女,高級實驗師,主要從事農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究,E‐mail‐zhaoxiaoyang@caas.cn