黃素華 ,李 焰,游 偉,曾福炎,鄧曉林,李曉冰

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建 龍巖 364000;2. 福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心,福建 龍巖 364000;3.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室,福建龍巖 364000)

銀杏葉復(fù)方對脾虛性斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)、上皮淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

黃素華1,2,李 焰1,3*,游 偉1,曾福炎1,鄧曉林1,李曉冰1

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建 龍巖 364000;2. 福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心,福建 龍巖 364000;3.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室,福建龍巖 364000)

為研究銀杏葉復(fù)方對脾虛性斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)、上皮淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響,試驗選擇25日齡健康斷奶仔豬30頭,隨機分成3組,即銀杏葉復(fù)方組、脾虛模型組和對照組,每組5個重復(fù),每個重復(fù)2頭.頸部注射利血平加饑飽失常法建立脾虛性腹瀉模型,銀杏葉復(fù)方進(jìn)行治療.預(yù)試7 d后進(jìn)行正式試驗,試驗期為30 d.結(jié)果表明:銀杏葉復(fù)方組回腸絨毛高度顯著高于脾虛模型組(P<0.05),十二指腸、回腸隱窩深度顯著低于脾虛模型組(P<0.05);銀杏葉復(fù)方組十二指腸絨毛高度/隱窩深度(V/C)顯著高于脾虛模型組(P<0.05),回腸V/C極顯著高于脾虛模型組(P<0.01);銀杏葉復(fù)方組十二指腸杯狀細(xì)胞數(shù)、空腸和回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于模型組(P<0.05).可知,銀杏葉復(fù)方有修復(fù)脾虛性斷奶仔豬的小腸組織的作用.

銀杏葉復(fù)方;脾虛性斷奶仔豬;腸黏膜形態(tài);淋巴細(xì)胞;杯狀細(xì)胞

現(xiàn)代化養(yǎng)豬場普遍采用早期斷奶技術(shù),導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)消化道發(fā)育不完全、免疫力低下和腹瀉等問題[1].中獸醫(yī)理論認(rèn)為,早期斷奶仔豬腹瀉的病因為脾弱濕盛、傷食積熱,辨證多屬脾虛[2].消化系統(tǒng)的免疫作用主要是通過小腸的免疫來實現(xiàn),脾虛泄瀉的發(fā)生機制與腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[3].如何增強動物腸道黏膜的免疫功能是提高脾虛斷奶仔豬免疫功能、防止腹瀉發(fā)生的關(guān)鍵.目前,對銀杏葉及其提取物的開發(fā)應(yīng)用的相關(guān)研究較多,但銀杏葉用于經(jīng)濟(jì)動物上的研究較少.據(jù)文獻(xiàn)報道[4],銀杏葉提取物可以抑制斷奶仔豬腸黏膜通透性的增加,保護(hù)腸黏膜屏障功能.但有關(guān)銀杏葉及其制劑影響脾虛性斷奶仔豬的研究尚不多見.本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),銀杏葉復(fù)方可修復(fù)脾虛性腹瀉斷奶仔豬的肝脾損傷[5]、增強脾虛證小鼠[6]和肉兔[7]的免疫作用.本試驗將進(jìn)一步探討銀杏葉復(fù)方對脾虛性斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)、上皮淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響,為銀杏葉在斷奶仔豬中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 銀杏葉復(fù)方的制備 銀杏葉復(fù)方由銀杏葉、黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、砂仁和陳皮組成(比例為10∶15∶15∶12∶15∶6∶9).以上方劑采用傳統(tǒng)水煎法煎煮:蒸餾水預(yù)行浸泡2 h,加熱煎煮2次,第1次保持微沸30 min,濾出藥液;藥渣加溫水再煮沸,仍保持微沸30 min,濾出藥液;合并2次濾液,小火濃縮至1 g/mL(按照生藥量計算)[6].

1.2 斷奶仔豬脾虛模型的建立 采用饑飽失常法(對斷奶仔豬采取不喂與喂飽,隔日交替)加每天頸部注射利血平(0.10 mL/kg)造模使其脾虛[8],3 d后仔豬便出現(xiàn)便溏或便軟,肛周污穢,繼而出現(xiàn)納呆、四肢無力、活動減少、毛色枯槁或豎毛、貪睡、喜臥、行動緩慢、反應(yīng)遲鈍等癥狀,表明脾虛模型復(fù)制成功[5].

1.3 試驗分組 選擇體重為(6.50±0.60)kg、25日齡健康斷奶仔豬30頭,隨機分成3組.銀杏葉復(fù)方組每天頸部注射0.10 mL/kg利血平加饑飽失常法造模,并灌服20 mL銀杏葉復(fù)方制劑;脾虛模型組每天頸部肌肉注射0.10 mL/kg利血平加饑飽失常法造模,并灌服20 mL生理鹽水;對照組每天頸部注射0.10 mL/kg生理鹽水,并灌服20 mL生理鹽水.每組5個重復(fù),每個重復(fù)2頭.預(yù)試期7 d,正式試驗期30 d.

1.4 指標(biāo)測定 第30天試驗結(jié)束后,禁食12 h,放血處死后切取十二指腸、空腸和回腸中段,在體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液固定后,制成切片觀察.參照李焰等[7]所用的方法測定腸絨毛高度和隱窩深度,絨毛高度/隱窩深度(V/C),計數(shù)腸上皮間淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞.

1.5 統(tǒng)計分析 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和 Duncan′s多重比較,所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.以P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉復(fù)方對脾虛性斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)的影響 由圖1可知,銀杏復(fù)方組的十二指腸絨毛排列緊密而有規(guī)律,且絨毛高度顯著高于脾虛模型組(P<0.05).脾虛模型組十二指腸絨毛低矮,排列不規(guī)則;銀杏復(fù)方組腸絨毛均完整,無脫落現(xiàn)象;脾虛模型組空腸腸絨毛存在脫落現(xiàn)象,絨毛周邊不完整,固有層與上皮層存在分離現(xiàn)象,對照組也存在上皮層與固有層分離現(xiàn)象;脾虛模型組回腸腸絨毛低矮,排列不規(guī)律,固有層與上皮層存在分離現(xiàn)象,對照組絨毛短,排列較散亂,而銀杏葉復(fù)方組腸絨毛結(jié)構(gòu)均完整.

圖1 各組腸道光鏡圖(HE,X40)

由表1可知,銀杏葉復(fù)方組回腸絨毛高度顯著高于脾虛模型組(P<0.05),十二指腸、回腸隱窩深度顯著低于脾虛模型組(P<0.05).銀杏葉復(fù)方組十二指腸V/C顯著高于脾虛模型組(P<0.05),回腸V/C極顯著高于模型組(P<0.01).

表1 銀杏葉復(fù)方對脾虛性斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)的影響(n=10)

2.2 銀杏葉復(fù)方對脾虛性斷奶仔豬上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響 由表2可知,脾虛模型組空腸和回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著低于對照組和銀杏葉復(fù)方組(P<0.05);脾虛模型組十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著低于對照組(P<0.05),銀杏葉復(fù)方組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目較脾虛模型組有所提高(P>0.05);對照組和銀杏葉復(fù)方組十二指腸杯狀細(xì)胞數(shù)目均顯著高于脾虛模型組(P<0.05),脾虛模型組空腸杯狀細(xì)胞數(shù)目顯著低于對照組(P<0.05),銀杏葉復(fù)方組較脾虛模型組有所提高(P>0.05);各組回腸杯狀細(xì)胞數(shù)目差異不顯著(P>0.05).

表2 銀杏葉復(fù)方對脾虛性斷奶仔豬腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響(n=10)

圖2 各組腸道細(xì)胞光鏡圖(X400)

由圖2可看出,十二指腸絨毛上皮細(xì)胞大體上呈單層排列,但部分出現(xiàn)細(xì)胞輪廓不清晰,排列不規(guī)則現(xiàn)象.上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以小淋巴細(xì)胞為主,胞核大而圓,濃染,胞漿少,多分散于小腸上皮基膜附近,少數(shù)位于上皮核層和頂層.散于上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞數(shù)目脾虛模型組少于銀杏葉復(fù)方組.回腸和空腸杯狀細(xì)胞被染成紫紅色,高腳杯狀,分布于高柱狀的柱狀細(xì)胞之間,多數(shù)集中分布在靠近腸腺部位,較少分布于靠近絨毛頂端附近.

3 討 論

研究表明,小腸絨毛高度的增加會增強小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,隱窩深度的增加則意味著吸收功能降低,二者比值是腸道消化吸收功能的重要指標(biāo)之一.小腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能受損情況下,V/C會下降[9].本試驗中,銀杏葉復(fù)方組回腸絨毛高度顯著高于脾虛模型組,十二指腸、回腸隱窩深度顯著低于脾虛模型組.銀杏葉復(fù)方組十二指腸V/C顯著高于脾虛模型組,回腸V/C極顯著高于模型組.銀杏葉復(fù)方組十二指腸杯狀細(xì)胞數(shù)、空腸和回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于模型組.表明銀杏葉復(fù)方可用于修復(fù)受損腸道,維護(hù)與養(yǎng)護(hù)斷奶仔豬的小腸黏膜組織.

上皮淋巴細(xì)胞是最先發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞,其數(shù)目可反映小腸局部黏膜屏障的完整性[10].本試驗中,銀杏葉復(fù)方組的空腸、回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞顯著高于脾虛模型組,說明銀杏葉復(fù)方對脾虛斷奶仔豬腸黏膜免疫屏障有一定促進(jìn)作用.杯狀細(xì)胞同樣是重要的免疫相關(guān)細(xì)胞,它可能在腸黏膜損傷后的重建過程中起關(guān)鍵作用,這與其分泌的黏液對上皮起潤滑保護(hù)作用有關(guān)[11].本試驗中,銀杏復(fù)方組的十二指腸腸段杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于脾虛模型組,說明銀杏復(fù)方劑對小腸黏膜免疫細(xì)胞有保護(hù)作用.

"脾虛證"是以消化功能低下為主的多器官和多系統(tǒng)功能減弱的綜合病理變化,仔豬斷奶產(chǎn)生應(yīng)激狀態(tài)時,腸形態(tài)和腸黏膜屏障受損.已有研究表明,銀杏葉提取物可提高腸道吸收能力[12],促進(jìn)斷奶仔豬生長[13],主要是由于銀杏葉含有黃酮類和萜內(nèi)酯,具有促進(jìn)毛細(xì)血管循環(huán)以及營養(yǎng)脾胃和心腦臟器功能的作用.本研究利用銀杏葉與黃芪、白術(shù)、黨參、茯苓、砂仁、陳皮等中草藥配制銀杏葉復(fù)方制劑,銀杏葉復(fù)方可修復(fù)受損腸道,維護(hù)與養(yǎng)護(hù)斷奶仔豬的小腸黏膜組織.因黨參、黃芪為補氣健脾、益血首選藥物,黃芪多糖可改善脾虛小鼠的消化吸收功能;黨參具益氣生津、健脾補肺之功[14];白術(shù)苦溫而善于燥濕,茯苓甘淡而善于滲濕,白術(shù)、茯苓合而用之,一燥一濕,相輔相成;砂仁也有化濕開胃,溫脾止瀉,陳皮常與黨參、白術(shù)、茯苓等配合應(yīng)用,既能健脾,又能理氣[15].所以黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、砂仁、陳皮配以銀杏葉相得益彰.

4 結(jié) 論

在本試驗條件下,銀杏葉復(fù)方有維持和保護(hù)仔豬小腸黏膜的作用.研究運用中藥方劑的君臣佐使理論,將銀杏葉配以黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、砂仁、陳皮等中藥,發(fā)揮其更好的療效,為研制以銀杏葉為主的中草藥飼料添加劑提供了一定的理論依據(jù).

[1] 湯艷. 仔豬早期斷奶綜合征的發(fā)生原因與防治措施[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2010, (21): 365‐366.

[2] 王長瓊. 淺談中獸醫(yī)藥的發(fā)展機遇與挑戰(zhàn)[J]. 中國獸藥雜志 , 2002, 36(7): 15‐16.

[3] 彭乃寶. 維護(hù)腸道屏障功能的重要性及措施[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2005, 26(10): 1182‐1184.

[4] 黃其春, 黃翠琴, 陳 彤, 等.銀杏葉提取物對斷奶仔豬生長性能、腸黏膜形態(tài)及屏障通透性的影響[J]. 中國畜牧雜志 , 2014, 50(19): 74‐77.

[5] 李焰, 馬也程, 孫艷發(fā), 等. 銀杏葉復(fù)方對脾虛證斷奶仔豬肝脾組織形態(tài)的影響[J]. 中國畜牧雜志, 2016, 52(19):56‐60.

[6] 李焰, 楊小燕, 黃其春, 等. 銀杏葉復(fù)方對脾虛證小鼠腸道推進(jìn)功能、抗疲勞和抗氧化作用的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué) , 2012, 39(2):170‐173.

[7] 李焰, 王華, 尹會方, 等. 銀杏葉復(fù)方對肉兔小腸黏膜形態(tài)及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 40(4): 529‐533.

[8] 虞紅, 李英倫. 仔豬脾虛狀態(tài)下SOD活力變化規(guī)律及加味四君子湯對其調(diào)整作用的試驗觀察[J]. 中國獸醫(yī)雜志,2007, 43(5): 41‐42.

[9] 石玉祥, 閆金坤, 王雪敏, 等. 中藥提取物對應(yīng)激小鼠腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量及IL‐2水平的影響[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué) , 2011, 41(1): 85‐88.

[10] Xu R J. Postnatal adaptation of the gastrointestinal tract in neonatal pigs: a possible role of milk‐borne growth factors[J]. Livest Prod Sci, 2000, 66(2): 95‐107.

[11] 常建星, 陳雙, 蔣龍元, 等. 小腸杯狀細(xì)胞在大鼠休克后腸黏膜重建中的作用[J]. 中華胃腸外科雜志, 2005, 8(6):510‐512.

[12] 黃其春, 陳彤, 鄭新添, 等. 銀杏葉提取物對斷奶仔豬養(yǎng)分消化率、消化酶活性及腸道吸收能力的影響[J]. 中國畜牧雜志, 2017, 53(3): 125‐128.

[13] 黃其春, 鄭新添, 鐘升平, 等. 銀杏葉提取物對斷奶仔豬生長性能、血清生化指標(biāo)和激素水平的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2011, 39(8): 51‐55.

[14] 李曉冰, 張征, 王鈺輝, 等. 銀杏葉復(fù)方和四君子湯對脾虛證小鼠血清消化酶活性的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2016, (6): 151‐153.

[15] 李焰, 鄧心慰, 曾福炎, 等. 銀杏葉復(fù)方對免疫抑制小鼠細(xì)胞因子和肝脾組織形態(tài)的影響[J]. 中國畜牧雜志,2015, 51(19): 71‐73.

Effects of Compound Ginkgo Biloba on the Morphology of Intestinal Mucosa and Number of Intraepithelial Lymphocytes and Goblet Cells in Weaned Pigs with Spleen Deficiency

HUANG Su‐hua1,2, LI Yan1,3*, YOU Wei1, ZENG Fu‐yan1, DENG Xiao‐lin1, LI Xiao‐bin1

(1. Collge of Life Science, Longyan University, Fujian Longyan 364000, China; 2. Fujian Provincial Engineering &
Technology Research Center for the Prevention and Control of Swine Diseases, Fujian Longyan 364000, China; 3. Fujian Provincial Key Laboratory for the Prevention and Control of Animal Infectious Diseases and Biotechnology, Fujian Longyan 364000, China)

In order to research the effects of compound ginkgo biloba on the morphology of intestinal mucosa and number of intraepithelial lymphocytes and goblet cells in weaned pigs with spleen deficiency, A total of 30 aged 25 days weaned piglets were randomly divided into 3 groups: control group, spleen deficiency model group and ginkgo biloba Compound treated group. Each group comducted 5 replicate experiments and each experiment repeated 2 piglets. Reserpine and poorly feeding methods were used to establish spleen deficiency diarrhea model followed by treated with ginkgo biloba Compound. The preliminary feeding periods were 7 d and the experiment feeding periods was that in 30 d. The results showed that the height of the ileacvillus was significantly higher in ginkgo biloba compound groups than that in spleen deficiency model group(P<0.05), the duodenal and ileac crypt depth were significantly lower in ginkgo bilobal compound group than that in spleen deficiency mode group (P<0.05). Ginkgo bilobal compound group showed much more duodenal V/C than spleen deficiency model group (P<0.05),and much more ileac V/C than spleen deficiency model group (P<0.01).Ginkgo bilobal compound group showed much more duodenal goblet cells , ileac and jejunal lymphocytes than spleen deficiency model group (P<0.05). The compound Ginkgo biloba can repair the small intestine tissues in spleen deficiency weaned pig.

Compound ginkgo biloba; Spleen deficiency weaned pig; Morphology of intestinal mucosa; Lymphocytes cells; Goblet cells

S828 .5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-086

2017-05-24;

2017-09-12

國家自然科學(xué)基金面上項目(31470129);福建省科技廳重大專項(2014NZ0002-3);龍巖市科技局項目(2014LY24);龍巖學(xué)院動物營養(yǎng)科研創(chuàng)新團(tuán)隊

黃素華(1968-),女,福建龍巖人,碩士,副教授,主要從事植物天然產(chǎn)物的提取及應(yīng)用,E-mail:1007388985@qq.com

*通訊作者:李焰(1968-),女,四川安縣人,碩士,教授,主要從事飼料添加劑研究,E-mail:529783204@qq.com