潘彩霞,熊 前,李川武,葉俊華

(公安部南昌警犬基地, 江西 南昌 330100)

德國(guó)牧羊犬發(fā)情期間唾液-血清孕酮相關(guān)性分析

潘彩霞,熊 前,李川武*,葉俊華*

(公安部南昌警犬基地, 江西 南昌 330100)

血清孕酮(P4)檢測(cè)可用于犬的發(fā)情鑒定及配種時(shí)間的確定,但血液樣本采集難度較大,若操作不當(dāng)還會(huì)給犬造成心理及生理上的傷害.與血液采集相比,唾液采集操作簡(jiǎn)便、無(wú)侵入性且不易對(duì)犬造成傷害,因此若能通過(guò)采集唾液代替血液測(cè)定犬生殖激素,對(duì)工作犬的繁育工作具有極大的現(xiàn)實(shí)意義.本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步測(cè)定德國(guó)牧羊犬發(fā)情期間唾液-血清P4的相關(guān)性,從而探討唾液代替血液進(jìn)行測(cè)定的可能性.實(shí)驗(yàn)選擇處于發(fā)情前期、3~5歲的5只德國(guó)牧羊犬,測(cè)定發(fā)情期間唾液與血清中P4的含量并進(jìn)行規(guī)律分析.結(jié)果表明:唾液中P4濃度在犬發(fā)情期間從0.08 ng/mL逐漸升高,到第15天達(dá)到0.47 ng/mL,與血液P4含量變化具有較高的相關(guān)性,在0.01水平上顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)平均達(dá)到0.890.通過(guò)擬合曲線分析,發(fā)現(xiàn)在y=0.0761ln(x)+0.1513曲線上有較高擬合度(R2=0.945 5).由此可見(jiàn),德國(guó)牧羊犬發(fā)情期間的唾液P4與血清P4具有良好的相關(guān)性,有望通過(guò)唾液代替血液測(cè)定犬發(fā)情期間生殖激素含量及分析變化規(guī)律.

唾液;血清;孕酮;相關(guān)性

母犬為一年單次或雙次發(fā)情,每次發(fā)情持續(xù)時(shí)間為9~11 d,適宜配種時(shí)間通常為4~6 d,一旦錯(cuò)過(guò)最佳配種時(shí)間,母犬受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)將受到影響.因此有效的母犬發(fā)情鑒定及最佳配種時(shí)間的確定在日常生產(chǎn)中非常重要.國(guó)內(nèi)外研究表明,母犬出現(xiàn)發(fā)情表現(xiàn)、卵細(xì)胞的發(fā)育、排卵等生理變化都是體內(nèi)一系列生殖激素變化導(dǎo)致的[1].如果母犬某些激素達(dá)到一定水平就會(huì)引起機(jī)體的相應(yīng)變化,若激素水平異常,則出現(xiàn)發(fā)情異常.因此可通過(guò)對(duì)母犬體內(nèi)生殖激素變化的測(cè)定進(jìn)行母犬發(fā)情鑒定,進(jìn)一步確定配種時(shí)間,從而避免因母犬隱性發(fā)情或發(fā)情癥狀不明顯導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)發(fā)情期.激素測(cè)定的常用手段是靜脈采血[2-3],但多次采血會(huì)對(duì)母犬機(jī)體造成一定創(chuàng)傷且易感染,同時(shí)采血時(shí)較大的應(yīng)激也會(huì)造成母犬激素分泌不穩(wěn)定,不利于母犬受孕.近年來(lái),有研究表明某些藥物及類固醇激素在唾液和血液中的濃度之間有著一定相關(guān)性[4-5].唾液檢測(cè)具有樣本收集方便且不具侵入性、不會(huì)給測(cè)試者造成壓力等優(yōu)點(diǎn),因此用唾液代替血液對(duì)受試者的體況進(jìn)行測(cè)定,既是受試者的期望也是國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷嘗試的方向.

常用的動(dòng)物發(fā)情鑒定激素有促黃體素(LH)、雌二醇(E2)及孕酮(P4).犬的LH釋放是脈沖式的,且持續(xù)釋放時(shí)間僅有2~3 d,這給LH的檢測(cè)帶來(lái)一定困難[6];另一方面,E2在犬排卵前達(dá)到峰值后濃度快速下降,不利于準(zhǔn)確檢測(cè)和分析[3].而P4在母犬發(fā)情期間增長(zhǎng)穩(wěn)定且釋放持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),有利于激素的觀測(cè)和分析.在上述前提下,本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展了德國(guó)牧羊犬發(fā)情期間唾液中P4濃度的檢測(cè)并研究其與血液P4濃度的相關(guān)性,以期通過(guò)測(cè)定唾液P4來(lái)鑒定母犬發(fā)情、確定配種時(shí)間.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)犬為公安部南昌警犬基地正常繁育使用的種用德國(guó)牧羊犬,從犬群中選出3~5歲、膘情中等、體況相似、生殖機(jī)能正常的中青年母犬.從中隨機(jī)選擇正處于發(fā)情前期的5只母犬,并以其發(fā)情周期中出現(xiàn)發(fā)情表征(陰道開(kāi)始出現(xiàn)血性分泌物)的當(dāng)天作為實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始采集樣本.

1.2 血液樣本采集及處理 當(dāng)母犬出現(xiàn)發(fā)情征兆,即陰道開(kāi)始出現(xiàn)血性分泌物時(shí)采血,每天采血1次,連續(xù)采集15 d.采血時(shí)間為08∶00-09∶00,前肢靜脈采血3 mL,3 600 r/min離心10 min,取血清至于密封管中,編號(hào)并保存于-80℃超低溫冰箱中待檢測(cè).

1.3 唾液樣本采集及處理

1.3.1 檸檬酸棉簽制備 配制5%的檸檬酸溶液,將棉簽浸沒(méi)于該溶液中,靜置3~5 min,使棉簽被檸檬酸溶液充分浸透,然后取出棉簽置于60℃烘箱中3 h[7].

1.3.2 唾液采集 采集時(shí),讓犬咬住硬物,保持口腔張開(kāi)狀態(tài),用檸檬酸處理過(guò)的棉簽擦拭犬的舌頭及口腔其他內(nèi)部位置,刺激犬的唾液自然流出,用一次性平皿采集流出的唾液,整個(gè)采集過(guò)程控制在30~60 s.將采集的唾液移至離心管,12 000 r/min離心10 min,取上清液至密封管中,編號(hào)并保存于-80℃超低溫冰箱中待檢測(cè).

1.4 激素測(cè)定 將處理好的唾液及血清樣本從-80℃超低溫冰箱中取出,放置4℃冰箱中使其溶解.用Beckman AccessTM全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)樣本中的P4含量.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 唾液及血清中P4的濃度值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,差異顯著性檢驗(yàn)(t-檢驗(yàn),P<0.01為顯著差異)及相關(guān)性分析均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析.

2 結(jié)果與分析

從圖1可以看出,發(fā)情前期,犬血清中的P4濃度一般在0~1.5 ng/mL,在9~11 d血清中的P4濃度達(dá)到2 ng/mL以上,隨后快速上升,這和國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者的研究結(jié)果保持一致[3,8].從唾液P4濃度變化可以看出,在發(fā)情前期,唾液中P4濃度一直維持在0.08~0.15 ng/mL,在9~11 d唾液中孕酮濃度顯著升高,達(dá)到0.2 ng/mL以上,隨后快速上升.唾液P4濃度的變化趨勢(shì)和血清P4濃度的變化趨勢(shì)相同,有較高的相關(guān)性.

圖1 發(fā)情期間唾液P4和血清P4濃度變化曲線

圖2 發(fā)情期間唾液P4與血清P4濃度的擬合曲線

將5只實(shí)驗(yàn)犬15 d的唾液和血清中P4濃度數(shù)值(150組數(shù)據(jù))在X-Y上做散點(diǎn)圖并進(jìn)行曲線擬合(圖2),在 y=0.0761ln(x)+0.1513曲線上唾液P4和血清P4有較好的相關(guān)性(R2=0.945 5).

由表1可知,唾液P4和血液P4的相關(guān)系數(shù)(R)為0.784~0.956,且均在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān),唾液P4和血液P4濃度之間的相關(guān)系數(shù)平均為0.890.以上結(jié)果表明,在犬的發(fā)情期間母犬血清P4與唾液P4之間有較好的相關(guān)性.

3 討 論

與血液中只有1%~15%具備生物活性的激素含量相比,所有能夠進(jìn)入唾液的激素都具備生物活性,因而唾液中激素的檢測(cè)價(jià)值遠(yuǎn)大于血液,加之唾液激素水平不受唾液流動(dòng)率或唾液酶的影響,故而唾液是極佳的診斷標(biāo)本,具備廣闊的研究及應(yīng)用前景.

表1 發(fā)情期間血清P4與唾液P4濃度關(guān)系

近年來(lái),隨著學(xué)界對(duì)唾液與血液指標(biāo)檢測(cè)的相關(guān)性研究日漸深入,指標(biāo)相關(guān)性的研究?jī)?nèi)容已經(jīng)從葡萄糖含量[9]、尿素氮及尿酸濃度[10]等逐步擴(kuò)展到類固醇激素.Bolaji[11]和Shoko等[12]發(fā)現(xiàn)了女性生理周期唾液P4和血液P4之間的相關(guān)性.從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,唾液中測(cè)得的P4濃度變化與血清中P4變化基本保持一致.前人研究表明[3,8],母犬在發(fā)情前期,血清P4水平非常低(0~1 ng/mL),卵巢上有卵泡,在LH增長(zhǎng)之前,血清P4含量就開(kāi)始上升,而當(dāng)LH達(dá)峰值時(shí),P4含量會(huì)達(dá)到1.5~2.5 ng/mL;當(dāng)P4達(dá)到這一水平,2 d后便開(kāi)始排卵,因此一般血清P4達(dá)到1.5~2.5 ng/mL后2~6 d內(nèi)為最佳配種時(shí)間.本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的血清P4變化與以往研究結(jié)果保持一致,且唾液P4濃度在犬發(fā)情期間從0.08 ng/mL逐漸升高,到第15天含量達(dá)到0.47 ng/mL,與血液P4含量變化具有較高的相關(guān)性,在0.01水平上顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)平均達(dá)到0.890.進(jìn)行擬合曲線分析,發(fā)現(xiàn)在y=0.0761ln(x)+0.151 3曲線上有較高擬合度(R2=0.945 5).本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,德國(guó)牧羊犬發(fā)情期間的唾液P4與血清P4具有良好的相關(guān)性,有望將唾液代替血液對(duì)母犬的激素變化進(jìn)行測(cè)定,以此對(duì)母犬進(jìn)行發(fā)情鑒定并判斷最佳配種時(shí)間.

本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果雖較為滿意,但仍存在許多不足.首先,本實(shí)驗(yàn)只隨機(jī)選取了5只正處發(fā)情的母犬,樣本量較小,與真正應(yīng)用于臨床實(shí)踐的要求仍存較大差距.其次,本實(shí)驗(yàn)僅選擇德國(guó)牧羊犬這一種品種作為研究對(duì)象,無(wú)法證實(shí)用唾液P4測(cè)定代替血清P4測(cè)定在其他犬種的應(yīng)用是否具有可行性.最后,犬的年齡、體重、身體狀況等的不同都會(huì)影響到唾液P4與血液P4的相關(guān)性.綜上所述,將唾液P4檢測(cè)運(yùn)用到母犬發(fā)情鑒定及最佳配種時(shí)間的確定,仍存在較多不確定因素,需進(jìn)一步探究.

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國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0501008);江西省警犬良種繁育與行為科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題基金;江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20161BBG70041)

潘彩霞(1992-),女,江西樂(lè)平人,碩士,實(shí)習(xí)研究員,主要從事動(dòng)物繁殖與育種工作,E-mail:412932303@qq.com

* 通訊作者:葉俊華,E-mail:yjh575757@163.com;李川武,E-mail:lechwu201@163.com