劉迎春,王 宏,陳鈺萌,高 峰,周歡敏

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞的成神經(jīng)誘導(dǎo)及初步鑒定

劉迎春1,2,王 宏1,2,陳鈺萌1,2,高 峰3*,周歡敏1,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

本研究旨在探究?jī)?nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞的成神經(jīng)誘導(dǎo)及初步鑒定.實(shí)驗(yàn)采用尼氏染色法對(duì)毛囊干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的情況進(jìn)行鑒定,利用RT-PCR技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)后的毛囊干細(xì)胞進(jìn)行基因水平檢測(cè).結(jié)果表明:內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞經(jīng)成神經(jīng)誘導(dǎo)后,細(xì)胞中有類似神經(jīng)元的細(xì)胞出現(xiàn),并且細(xì)胞周圍出現(xiàn)許多微管樣的結(jié)構(gòu),經(jīng)尼氏染色呈陽(yáng)性.誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記基因β-TubulinIII和NSE呈陽(yáng)性表達(dá),表明內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞具有分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能.

內(nèi)蒙古絨山羊;毛囊干細(xì)胞;誘導(dǎo)分化;RT-PCR

干細(xì)胞(Stem Cells)是一種存在于體內(nèi)具有自我更新和多向分化潛能的特殊細(xì)胞,其有能力演變?yōu)檎麄€(gè)機(jī)體的細(xì)胞[1].毛囊干細(xì)胞(Hair Follicle Stem Cells,FSC)是存在于毛囊里的原始細(xì)胞,其有潛能增殖分化為表皮、汗腺和皮脂腺等多種上皮組織[2].在體外培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞還可以分化為脂肪細(xì)胞[3]、血細(xì)胞[4]等.由于干細(xì)胞在體外經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)后具有跨胚層分化的能力,所以體外誘導(dǎo)法是鑒定干細(xì)胞的常用方法.因此,本實(shí)驗(yàn)在已分離純化的內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞基礎(chǔ)上,利用體外誘導(dǎo)法來(lái)誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞,旨在鑒定分離純化得到的內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞具有跨胚層分化的能力.

1 材料與方法

1.1 毛囊干細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇 自液氮中取出已分離純化的P3代毛囊干細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室提供)[5],迅速放入37℃水浴鍋,鑷子夾住震蕩直至沒(méi)有明顯的冰塊時(shí)取出.用75%酒精擦凈管口后迅速移進(jìn)超凈工作臺(tái),取細(xì)胞液,移到1.5 mL離心管,1 500 r/min離心5 min,棄除上清液,干細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%10FBS +1%PS+EGF 20 ng/mL + ITS 10 μl/mL)重懸細(xì)胞,后將細(xì)胞接種到事先用IV型膠原包被的60 mm培養(yǎng)皿中,移入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).

1.2 毛囊干細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 細(xì)胞長(zhǎng)到70%~80%融合時(shí),使用兩步酶消化法傳代培養(yǎng).棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液,加適量的含有雙抗(青霉素+鏈霉素)的PBS溶液清洗2遍后棄掉,向培養(yǎng)皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,待消化1~5 min向培養(yǎng)皿中加入等體積干細(xì)胞培養(yǎng)液停止消化.將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入1.5 mL的離心管中,1 500 r/min離心5 min,棄除上清,干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞計(jì)數(shù)板法,細(xì)胞數(shù)/mL=4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4X104個(gè)/mL).

1.3 毛囊干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo) 取上述傳代的細(xì)胞接種于12孔板中;顯微鏡觀察待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)為50%~60%融合的時(shí)候,隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組加入神經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)液(DMEM/F12 +10%FBS +1 mmol/L β-巰基乙醇),對(duì)照組加入普通培養(yǎng)液(DMEM/F12 +10%10FBS +1%PS),置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)24 h.24 h后取適量PBS清洗1遍,實(shí)驗(yàn)組加入神經(jīng)誘導(dǎo)液(DMEM/F12 +10%FBS+3 mmol/L β-巰基乙醇),對(duì)照組不變,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每天更換培養(yǎng)液1次,每天注意在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的變化,并使用尼氏染色試劑盒染色鑒定神經(jīng)細(xì)胞.

表1 神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記基因引物序列

1.4 毛囊干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞特異表達(dá)基因鑒定 神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和神經(jīng)微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)為神經(jīng)細(xì)胞的特異表達(dá)基因,利用Priemer 5.0軟件設(shè)計(jì)合成引物,并由上海生工公司合成(表1).首先用RNAiso Plus裂解已誘導(dǎo)的毛囊干細(xì)胞,然后提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過(guò)PCR體系和1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 毛囊干細(xì)胞的傳代與復(fù)蘇 將解凍后的毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)2 d,顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后,有明顯鋪路石狀生長(zhǎng)的細(xì)胞即為毛囊干細(xì)胞;高倍顯微鏡繼續(xù)觀察,發(fā)現(xiàn)毛囊干細(xì)胞的細(xì)胞核較大,占細(xì)胞大部分位置,即核質(zhì)比大,同時(shí)可以觀察到核仁,可見(jiàn)細(xì)胞有明顯的幼稚細(xì)胞的狀態(tài)(圖1).

圖1 毛囊干細(xì)胞的傳代與復(fù)蘇

2.2 毛囊干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo) 誘導(dǎo)前,對(duì)毛囊來(lái)源干細(xì)胞進(jìn)行尼氏染色,發(fā)現(xiàn)部分毛囊來(lái)源干細(xì)胞中有少量尼氏顆粒的存在,但是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征(圖2A、2A′).經(jīng)過(guò)神經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)24 h,部分細(xì)胞開(kāi)始慢慢變圓,細(xì)胞兩極伸出細(xì)長(zhǎng)突起,狀似雙極神經(jīng)元細(xì)胞,而且細(xì)胞旁有生長(zhǎng)出很多微管樣的結(jié)構(gòu)形態(tài);更換正式神經(jīng)誘導(dǎo)液后誘導(dǎo)24 h,細(xì)胞旁的這種結(jié)構(gòu)有所增多(圖2B).繼續(xù)誘導(dǎo)24 h,有更多的細(xì)胞旁邊延伸出突起(圖2C).有的細(xì)胞伸出數(shù)條樹(shù)突狀突起,類似星形膠質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞周圍出現(xiàn)微管樣結(jié)構(gòu)有所增加,發(fā)現(xiàn)有類神經(jīng)元細(xì)胞,經(jīng)尼氏染色呈陽(yáng)性.

圖2 毛囊來(lái)源干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo)(200X)

2.3 毛囊干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記基因鑒定 RT-PCR法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異表達(dá)基因β-Tubulin III 和NSE都呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,利用特異性引物擴(kuò)增3個(gè)目的基因片段,電泳顯示條帶清晰且單一,無(wú)非特異擴(kuò)增,可知β-Tubulin III 的片段大小約為145 bp,NSE的片段大小約為253 bp,與設(shè)計(jì)的片段大小符合(圖3).

3 討 論

圖3 毛囊干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo)(基因檢測(cè))

現(xiàn)如今,干細(xì)胞的研究逐步受到科研人員的重視,隨著對(duì)干細(xì)胞的研究不斷深入,發(fā)現(xiàn)毛囊干細(xì)胞也具有干細(xì)胞的普遍特點(diǎn):慢周期性;在超微結(jié)構(gòu)和生化特征方面保留著未分化細(xì)胞的特征;具有自我更新和多向分化潛能;可分裂產(chǎn)生過(guò)渡放大細(xì)胞;發(fā)現(xiàn)的部位較隱蔽、安全,營(yíng)養(yǎng)環(huán)境較好;體外克隆形成率高[6].因此,毛囊干細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)成為深入探究毛囊干細(xì)胞的一個(gè)重要內(nèi)容.

毛囊干細(xì)胞在體外經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)具有跨胚層分化的能力,可以采用誘導(dǎo)分化的方法來(lái)鑒定所分離的細(xì)胞.檢測(cè)毛囊干細(xì)胞的多向分化潛能,能夠成為鑒定干細(xì)胞的一個(gè)重要的判斷標(biāo)準(zhǔn).在不同的實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)細(xì)胞,毛囊干細(xì)胞可表達(dá)其多向分化潛能,可以向多數(shù)不同的細(xì)胞組織定向分化.Drewa等[7]通過(guò)條件培養(yǎng)基將毛囊來(lái)源干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為尿路上皮細(xì)胞.另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)毛囊干細(xì)胞可以在TGF-β1的誘導(dǎo)下分化為平滑肌細(xì)胞[8].最新研究發(fā)現(xiàn)毛囊來(lái)源干細(xì)胞在體外還可以誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞[9].也有研究證明人多潛能毛囊干細(xì)胞具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能[10].毛囊干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo)后可以表達(dá)一些神經(jīng)元細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)志物: NSE和β-tubulinⅢ.NSE是一種參與糖酵解途徑的烯醇化酶,存在于神經(jīng)組織和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中[11].β-tubulinⅢ是編碼β微管蛋白家族的Ⅲ類成員,β微管蛋白是異源二聚化和組裝形成微管的2個(gè)核心蛋白家族(α和β微管蛋白)之一,該蛋白質(zhì)主要在神經(jīng)元中表達(dá),可能參與神經(jīng)發(fā)生和軸突引導(dǎo)和維持[12].本實(shí)驗(yàn)中,在加入神經(jīng)誘導(dǎo)液之前毛囊干細(xì)胞多呈鋪路石狀緊密排列且生長(zhǎng)均一;加入神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后細(xì)胞樣拉長(zhǎng),呈長(zhǎng)梭型并且生長(zhǎng)不均一,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的不斷加長(zhǎng)細(xì)胞聚集性生長(zhǎng),開(kāi)始由長(zhǎng)梭形變成不規(guī)則形狀,其中可發(fā)現(xiàn)有類神經(jīng)元細(xì)胞,經(jīng)過(guò)尼氏染色后呈陽(yáng)性.在誘導(dǎo)3 d后利用RT-PCR技術(shù)鑒定NSE和β-tubulin Ⅲ基因的表達(dá)量,通過(guò)誘導(dǎo)后可以發(fā)現(xiàn)NSE和β-tubulin Ⅲ 表達(dá)呈陽(yáng)性.

4 小 結(jié)

在本實(shí)驗(yàn)條件下,體外分離培養(yǎng)的內(nèi)蒙古白絨山羊毛囊干細(xì)胞經(jīng)特定誘導(dǎo)可以定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,具有分化神經(jīng)細(xì)胞的能力.

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S827.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-052

2017-05-31;

2017-07-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160445)

劉迎春(1978-),女,副教授,研究方向?yàn)楦杉?xì)胞信號(hào)通路,E-mail:liuyingchun1994@aliyun.com

* 通訊作者:高峰(1978-),男,教授,E-mail:gaofeng1994@sina.com