黃 玉,蔡 蓓,王小龍,陳玉林

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

編者按

2017年《中國畜牧雜志》全面改版.為更好展示畜牧學(xué)領(lǐng)域的科技前沿,促進(jìn)學(xué)術(shù)交流,本刊特別邀請不同領(lǐng)域的專家或青年骨干,圍繞各自的研究領(lǐng)域,介紹自己、團(tuán)隊或國際研究機(jī)構(gòu)近幾年的研究成果、存在問題及研究展望,或就當(dāng)前的研究熱點問題進(jìn)行討論和評論.2017年第一期自副主編開始,將為讀者帶來相關(guān)綜述,希望能引發(fā)讀者對相關(guān)熱點、難點的思考,并進(jìn)行深入探討.

通過CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制基因編輯山羊和綿羊模型

黃 玉,蔡 蓓,王小龍,陳玉林*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

山羊和綿羊不僅是重要的經(jīng)濟(jì)動物,更是基因編輯的模式動物.基因編輯山羊、綿羊的研究對動物生產(chǎn)性能改善、生物醫(yī)學(xué)和生物制藥的研究都具有重要的意義.羊的基因編輯技術(shù)興起于20世紀(jì)80年代,Hamme等[1]將鼠的金屬硫蛋白基因和人生長激素基因通過顯微注射技術(shù)導(dǎo)入綿羊原核期胚胎中,成功獲得了世界上第1只用顯微注射法制備的轉(zhuǎn)基因綿羊,這種顯微注射DNA片段的方法建立了綿羊基因編輯的概念,但該方法的基因編輯效率較低、靶基因的整合具有隨機(jī)性、表型不可預(yù)知;至20世紀(jì)90年代,體細(xì)胞核移植技術(shù)的出現(xiàn),再次掀起了基因編輯的熱潮,Wilmut等[2]通過成年動物體細(xì)胞克隆法獲得了第1只基因編輯綿羊;2000年以后,慢病毒系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子、RNA干擾、精子介導(dǎo)法以及位點特異性重組酶等新技術(shù)的興起和應(yīng)用,大大推進(jìn)了動物基因編輯研究與應(yīng)用的進(jìn)程;迄今,已發(fā)現(xiàn)ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9等限制性核酸內(nèi)切酶可在基因組內(nèi)特定位點造成雙鏈斷裂,尤其是2012年CRISPR/Cas9系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用,讓生產(chǎn)靶向基因編輯的動物成為了可能[3].截至2015年,基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠[4]、豬[5]、羊[6-7]等哺乳動物上已有一些成功案例.本文主要綜述2015年以來本課題組基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開展基因編輯山羊和基因編輯綿羊的研究情況,并與國內(nèi)外的同類研究進(jìn)行了比較和前景分析.

1 山羊、綿羊基因編輯靶基因的選擇

2014年,本課題組選擇陜北白絨山羊和寧夏肉裘兼用的灘羊(綿羊)作為基因編輯模式動物,旨在通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)制備具備多個優(yōu)良性狀的基因編輯山羊和綿羊,構(gòu)建相應(yīng)的核心育種群.在山羊靶基因選擇時,選取了具有抑制絨毛生長功能的成纖維細(xì)胞生長因子5(Fibroblast Growth Factor‐5,FGF5)基因[8]和已在小鼠[9]、牛[10]等多個物種上證實具有抑制肌肉發(fā)育功能的肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN)基因作為靶向敲除的目標(biāo)基因;在綿羊靶基因選擇時,選擇了MSTN基因、影響脂肪顏色的β-胡蘿卜素雙脫氧加氫酶(β‐carotene‐9′,10′‐dioxygenase,BCO2)基因和影響毛色的刺鼠信號蛋白(Agouti Signal Protein,ASIP)作為目標(biāo)基因.

2 基因編輯山羊、綿羊的制備效率

針對上述山羊、綿羊的基因編輯靶基因,本課題組設(shè)計了相應(yīng)的sgRNA,經(jīng)過sgRNA篩選,進(jìn)行細(xì)胞水平切割效率實驗、胚胎sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射效果實驗,證明靶基因的sgRNA在細(xì)胞水平的切割效率可達(dá)50%~80%,羊原核胚胎(受精卵1細(xì)胞期)sgRNA和Cas9 mRNA的顯微注射濃度分別為5、20 ng/μL時切割效果較為理想.2014年10月-11月,按照圖1所示,技術(shù)路線進(jìn)行了原核胚胎微注射和胚胎移植.2015年3月-5月,分別獲得山羊(陜北白絨山羊)羔羊98只(活羔93只),綿羊(寧夏灘羊)羔羊54只(活羔36只).在基因編輯山羊羔中,FGF5基因編輯陽性羊占21.4%(21/98,包括5只流產(chǎn)死羊),MSTN基因編輯陽性羊為15.3%(15/98),FGF5和MSTN雙基因突變的陽性羊為10.2%(10/98)[11];在基因編輯綿羊羔中,MSTN陽性羊27.8%(10/36),ASIP陽性羊33.3%(12/36),BCO2陽性羊27.8%(10/36)[12].同時還對基因編輯陽性羊的生殖細(xì)胞進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、T7E1酶切和Sanger測序分析,充分證明了基因編輯個體可以穩(wěn)定地將突變遺傳給下一代[13].

2014年陳創(chuàng)夫團(tuán)隊利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得了3只基因編輯的山羊,這3只羔羊均為基因編輯羊;在此之前連正興課題組[5]也用此方式獲得了35只綿羊,但MSTN單基因編輯的陽性率僅為5.7%(2/35).分析表明,通過胚胎顯微注射法獲得基因編輯羊的成功率較高、制作成本較低,詳見表1.通過將CRISPR/Cas9系統(tǒng)顯微注射到1細(xì)胞期原核胚胎后可在24 h內(nèi)進(jìn)行胚胎移植,此方法可用于大規(guī)模創(chuàng)制基因編輯羊,值得關(guān)注的問題是獲得的基因編輯陽性個體中嵌合體羔羊比例較高.相比較而言,基因編輯結(jié)合體細(xì)胞核移植的方法的基因編輯效率很低,一旦胚胎移植獲得成功,其基因編輯的陽性率可達(dá)100%.

上述基因編輯效率實驗結(jié)果低于在小鼠[4]、兔子[14]、豬[5]、狗[15]、猴子[16-17]等哺乳動物中的編輯效率.2013年使用Cas9 mRNA和sgRNA進(jìn)行小鼠基因編輯的單基因編輯個體陽性率已達(dá)到60%~95%,2014年在基因編輯豬的創(chuàng)制中達(dá)到63%的單基因陽性率,2015年創(chuàng)制基因編輯猴子的單基因陽性率為23%~61%,2015年國外的團(tuán)隊創(chuàng)制基因編輯綿羊的陽性率為45.45%(10/22)[6],而本研究的單基因編輯陽性率僅為15%~33%.目前研究人員不斷優(yōu)化Cas9系統(tǒng)使其具備更高的特異性和編輯效率[18],在小鼠上的研究表明使用Cas9蛋白替代Cas9 mRNA進(jìn)行胚胎注射能大幅度提高編輯效率[19],2016年在豬上的研究發(fā)現(xiàn)使用電穿孔轉(zhuǎn)染Cas9蛋白的方式不僅可以提高編輯效率,減小胚胎注射對胚胎的損傷,還可獲得純合的陽性個體[20].基因的改變、sgRNA的效率等因素都會影響創(chuàng)制基因編輯效率,與小鼠、兔子、豬等一胎多仔的動物相比,獲得基因編輯羊的成本會更高,提高編輯效率是基因編輯羊成本下降的重要途徑.

圖1 基因編輯羊創(chuàng)制及表型分析的總體技術(shù)路線

3 基因編輯山羊、綿羊的脫靶效應(yīng)

在動物基因編輯過程中,CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)問題是備受重視的技術(shù)問題和生物安全問題.理論上,脫靶效應(yīng)主要由sgRNA中鄰近"PAM"位點的12個堿基(稱為"種子區(qū)")序列所決定.將種子序列與基因組序列進(jìn)行比對,一般可篩選出0~5個錯配位點,錯配數(shù)越低的位點,發(fā)生脫靶的可能性越大.脫靶效應(yīng)的檢測是通過PCR、T7E1酶切和測序法對潛在脫靶位點進(jìn)行驗證,在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)制備綿羊[6]的過程中也檢測到了脫靶效應(yīng)的存在.有研究表明,通過選擇合適的sgRNA可以有效提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性,降低脫靶率.在基因編輯小鼠[4]、豬[5]、狗[15]、猴子[16-17]等動物的制備中均未檢測到脫靶效應(yīng).

本研究表明,在基因編輯羊的制備過程中,脫靶效應(yīng)是存在的,在MSTN基因的OT5位點和FGF5基因的OT7位點檢測到脫靶效應(yīng),而基因編輯綿羊制備過程中,由于重視研究了靶基因sgRNA脫靶效應(yīng)問題,事先使用SeqMap[20]對sgRNA的靶位點進(jìn)行了預(yù)測,先后3批次的實驗結(jié)果表明,在潛在脫靶位點未檢測到脫靶突變[12],沒有出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象.

4 基因編輯山羊、綿羊的表型

在經(jīng)濟(jì)動物的品種培育過程中,基因工程的技術(shù)手段有助于縮短育種時間、快速提高和改善動物生產(chǎn)性能[21].本課題組通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)制了基因編輯陽性羊群體,針對不同基因的功能分別對不同的基因編輯陽性羊展開了研究.對10只MSTN陽性羊和10只野生型羊從出生至240 d的體重監(jiān)測結(jié)果表明,MSTN陽性山羊、綿羊的體重均顯著高于野生型羊,且陽性羊的肌纖維直徑更寬、肌纖維橫截面積更大,表明MSTN基因突變造成基因編輯羊肌肉發(fā)育能力的提高[11].這一研究結(jié)果與MSTN基因在鼠、兔子、豬、狗以及其他山羊和綿羊的研究結(jié)果相符.對FGF5陽性絨山羊0~120 d的羊絨長度的檢測表明,其絨毛長度和密度指標(biāo)均顯著高于野生型絨山羊[13].

CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)制基因編輯羊的應(yīng)用,也有助于建立動物疾病模型,為某些與基因型相關(guān)的動物疾病提供新的解決思路.Whitworth等[22]的研究發(fā)現(xiàn),通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對CD163基因進(jìn)行破壞后的豬能抵抗豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的感染.有研究表明,羊的黃脂性狀和某些代謝疾病存在一定關(guān)聯(lián).本課題組對BCO2陽性綿羊脂肪顏色進(jìn)行觀測,將其與雜合型和野生型個體進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)BCO2雙等位基因突變組的綿羊脂肪呈黃脂性狀,表明BCO2發(fā)生雙等位基因突變導(dǎo)致了黃脂的產(chǎn)生[23].

表1 基因工程產(chǎn)生山羊和綿羊的預(yù)期結(jié)果

如今一些借助基因工程技術(shù)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物已被批準(zhǔn)用于生物醫(yī)藥的生產(chǎn),其中包括山羊產(chǎn)生的生物藥品ATryn1(人抗凝血酶-III);美國食物藥品管理局(FDA)于2015年批準(zhǔn)了通過基因編輯改造后生長更迅速的轉(zhuǎn)基因三文魚的上市[24].

5 前景展望

綜上,CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)點:一是可對特定基因進(jìn)行靶向編輯;二是可同時對多個基因進(jìn)行定向編輯以實現(xiàn)多基因聚合;三是可提高基因編輯效率和降低制備成本.不斷優(yōu)化CRISPR/Cas9技術(shù)體系提高基因編輯效率,結(jié)合諸如體細(xì)胞核移植技術(shù)解決基因編輯個體的嵌合體問題是基因編輯技術(shù)在羊分子聚合育種中得以推廣應(yīng)用的關(guān)鍵.除此之外,加快山羊、綿羊重要性狀相關(guān)功能基因的研究是基因編輯技術(shù)應(yīng)用取得實效的前提與基礎(chǔ).

[1] Hammer R E, Pursel V G, Jr R C, et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection[J].Nature,1985, 315(6021):680‐683.

[2] Schnieke A E, Kind A J, Ritchie W A, et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts[J]. Science,1997,278(5346):2130‐2133.

[3] Menchaca A, Anegon I, Whitelaw C B, et al. New insights and current tools for genetically engineered (GE) sheep and goats[J]. Theriogenology, 2016, 86(1):160‐169.

[4] Wang H, Yang H, Shivalila C S, et al. One‐step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas‐mediated genome engineering[J]. Cell, 2013,153(4):910‐918.

[5] Hai T, Teng F, Guo R, et al. One‐step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system[J]. Cell Res, 2014, 24(3):372.

[6] Crispo M, Mulet A P, Tesson L, et al. Efficient generation of myostatin knock‐out sheep using CRISPR/Cas9 technology and microinjection into zygotes[J]. PLoS One,2015, 10(8):e0136690.

[7] Ni W, Qiao J, Hu S, et al. Efficient gene knockout in goats using CRISPR/Cas9 system[J]. PLoS One, 2014,9(9):e106718.

[8] He X, Chao Y, Zhou G, et al. Fibroblast growth factor 5‐short (FGF5s) inhibits the activity of FGF5 in primary and secondary hair follicle dermal papilla cells of cashmere goats[J]. Gene, 2016, 575(2):393‐398.

[9] Hao G, Yong C, Qiu B, et al. Establishment and phenotypic analysis of an Mstn knockout rat[J]. Biochem Bioph Res Co, 2016, 477(1):115.

[10] Proudfoot C, Carlson D F, Huddart R, et al. Genome edited sheep and cattle[J]. Transgenic Res, 2015, 24(1):147‐153.

[11] Wang X, Yu H, Lei A, et al. Generation of gene‐modified goats targeting MSTN and FGF5 via zygote injection of CRISPR/Cas9 system[J]. Sci Rep U K, 2015, 5:13878.

[12] Wang X, Niu Y, Zhou J, et al. Multiplex gene editing via CRISPR/Cas9 exhibits desirable muscle hypertrophy without detectable off‐target effects in sheep[J]. Sci Rep U K, 2016, 6:32271.

[13] Lv Q, Yuan L, Deng J, et al. Efficient generation of myostatin gene mutated rabbit by CRISPR/Cas9[J]. Sci Rep‐UK, 2016, 6:25029.

[14] Zou Q, Wang X, Liu Y, et al. Generation of gene‐target dogs using CRISPR/Cas9 system[J]. J Mol Cell Biol, 2015,7(6):580‐583.

[15] Niu Y, Shen B, Cui Y, et al. Generation of gene‐modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA‐mediated gene targeting in one‐cell embryos[J]. Cell, 2014, 156(4):836‐843.

[16] Chen Y, Zheng Y, Yu K, et al. Functional disruption of the dystrophin gene in rhesus monkey using CRISPR/Cas9[J].Hum Mol Cenet, 2015, 24(13):3764.

[17] Zhang X, Liang P, Ding C, et al. Efficient production of gene‐modified mice using Staphylococcus aureusCas9[J].Sci Rep U K, 2016, 6:32565.

[18] Qin W, Dion S L, Kutny P M, et al. Efficient CRISPR/Cas9‐mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease[J]. Genetics, 2015, 200(2):423‐430.

[19] Tanihara F, Takemoto T, Kitagawa E, et al. Somatic cell reprogramming‐free generation of genetically modified pigs[J]. Sci Adv, 2016, 2(9):e1600803‐e1600803.

[20] Hruscha A, Krawitz P, Rechenberg A, et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off‐target effects in zebrafish[J]. Development, 2013, 140(24):4982‐4987.

[21] Van Eenennaam A L. Genetic modification of food animals[J]. Curr Opin Biotech, 2017, 44:27‐34.

[22] Whitworth K M, Rowland R R, Ewen C L, et al. Gene‐edited pigs are protected from porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Nat Biotechnol, 2015,34(1):20.

[23] Niu Y, Jin M, Li Y, et al. Biallelic β‐carotene oxygenase 2 knockout results in yellow fat in sheep via CRISPR/Cas9[J]. Anim Genet, 2016, 48(2):242‐244.

[24] Wang X, Cai B, Zhou J, et al. Disruption of FGF5 in cashmere goats using CRISPR/Cas9 results in more secondary hair follicles and longer fibers[J]. PLoS One,2016, 11(10):e0164640.

10.19556/j.0258-7033.2017-11-001

寧夏農(nóng)牧廳灘羊育種專項(NXTS201601);國家自然科學(xué)基金(31372279、31402038、31572369);陜西省重點研發(fā)計劃(2017NY-072)

黃玉(1994-),女,碩士研究生,研究方向為動物遺傳育種與繁殖,E-mail:1215234902@qq.com

*通訊作者:陳玉林(1964-),男,教授,研究方向為動物遺傳資源研究,E-mail:chenyulin@nwafu.edu.cn