李峻，陳劼，孫雪梅，朱學(xué)軍，姜鵬君，陳健一，倪海雯，張文曦，夏雯

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院)，江蘇 南京 210029)

血復(fù)生浸膏結(jié)合辨證治療對(duì)重型再障患者外周血microRNA、淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的影響

李峻，陳劼，孫雪梅，朱學(xué)軍，姜鵬君，陳健一，倪海雯，張文曦，夏雯

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院)，江蘇 南京 210029)

目的：研究血復(fù)生浸膏結(jié)合辨證治療重型再障(SAA)的療效及對(duì)外周血microRNA、淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子的影響。方法：再障患者均來源于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，分為治療組30例和對(duì)照組30例，治療組應(yīng)用中醫(yī)治療+基礎(chǔ)治療，對(duì)照組僅用基礎(chǔ)治療；中醫(yī)治療為血復(fù)生浸膏結(jié)合辨證分型隨證加減，腎陰虛型患者服用血復(fù)生浸膏合左歸丸、知柏地黃丸、犀角地黃湯加減，腎陽虛型患者服用血復(fù)生浸膏合右歸丸加減，腎陰陽兩虛型患者服用血復(fù)生浸膏合左歸丸、右歸丸加減，熱毒壅盛型患者服用血復(fù)生浸膏合清瘟敗毒飲、犀角地黃湯加減；基礎(chǔ)治療為環(huán)孢素、十一酸睪酮、輸血等對(duì)癥支持治療，兩組均治療6個(gè)月。采用實(shí)時(shí)定量PCR(realtime PCR)方法檢測(cè)SAA患者治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMNC)miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)情況，采用流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)CAA患者治療前后淋巴細(xì)胞亞群及血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α、TGF-β1水平。結(jié)果：治療組總有效率高于對(duì)照組(63.3% Vs 36.7%，P=0.039)；治療前SAA患者PBMNC miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)、Tc比例、血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α水平均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，而Th比例、Th/Tc比值、TGF-β1水平則低于正常對(duì)照組(P<0.01)；治療組患者治療6個(gè)月后miRNA-1260b表達(dá)、IFN-γ、TNF-α水平均明顯下降(P<0.01)，miRNA-155-5p、Tc比例、IL-12p70亦有所下降(P<0.05)，TGF-β1水平明顯升高(P<0.01)，而Th比例、Th/Tc比值、NK比例也有所升高(P<0.05)，但上述指標(biāo)尚未達(dá)到正常水平，治療組上述指標(biāo)變化較對(duì)照組更明顯。結(jié)論：miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)、造血調(diào)控因子紊亂在SAA免疫異常的發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用；血復(fù)生浸膏結(jié)合辨證治療重型再障療效優(yōu)于單純西藥治療組，其作用機(jī)理包括下調(diào)miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)，改善淋巴細(xì)胞亞群失衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子紊亂，進(jìn)而減輕異?？哼M(jìn)的細(xì)胞免疫，解除造血抑制。

重型再生障礙性貧血；微小RNA；淋巴細(xì)胞亞群；細(xì)胞因子；血復(fù)生浸膏

再生障礙性貧血(aplastic anemia，簡(jiǎn)稱AA)是一種以全血細(xì)胞減少和骨髓造血衰竭為特征的血液系統(tǒng)難治性疾病。根據(jù)血象及骨髓增生減低情況，再障可分為重型再障(severe aplastic anemia，簡(jiǎn)稱SAA)和非重型再障(non-severe aplastic anemia，簡(jiǎn)稱NSAA)。目前再障被公認(rèn)為是一種以骨髓造血組織為靶器官的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。microRNA (miRNA)是一種保守、非編碼的小分子RNA，能夠結(jié)合到目標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，使之降解或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的目的。近年來研究表明miRNA在調(diào)控固有免疫及適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用[1]，miRNA失調(diào)可導(dǎo)致多種自身免疫性疾病，小鼠模型實(shí)驗(yàn)中糾正失調(diào)的miRNA可起到控制疾病的作用，因而miRNA可作為疾病診斷的新型標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)。我們前期運(yùn)用miRNA表達(dá)譜芯片篩查再障患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA差異表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)重型再障患者具有特異性miRNA差異表達(dá)譜，其中miRNA-155-5p和miRNA-1260b均表達(dá)上調(diào)。治療上，重型再障主要是抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)/抗淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG)聯(lián)合環(huán)孢素的免疫抑制療法、異基因造血干細(xì)胞移植及刺激造血、輸血等支持治療，國(guó)內(nèi)由于ATG/ALG及其后期支持治療費(fèi)用昂貴，造血干細(xì)胞移植供體來源不足、費(fèi)用高、風(fēng)險(xiǎn)大，使得兩者在臨床應(yīng)用受到限制。中醫(yī)藥治療再障具有安全、有效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，一直是國(guó)內(nèi)治療再障的重要手段之一。我科在多年臨床實(shí)踐和文獻(xiàn)挖掘整理基礎(chǔ)上，創(chuàng)制了具有補(bǔ)腎填精、益髓生血作用的院內(nèi)制劑“血復(fù)生浸膏”(鹿角片、紫河車、菟絲子、熟地黃、何首烏、淫羊藿、黃芪、當(dāng)歸、女貞子、旱蓮草等)，以血復(fù)生浸膏為治療基本方，結(jié)合辨證分型隨證加減，治療再障療效顯著，且未見明顯毒副作用[2-3]。我們將近期血復(fù)生浸膏為主聯(lián)合環(huán)孢素、雄激素治療重型再障，并研究治療前后患者外周血miRNA、淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子的變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

所有病例均來源于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2013年8月—2016年7月期間血液科病房重型再生障礙性貧血患者，共60例，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組。治療組30例，包括14例SAA-Ⅰ、16例SAA-Ⅱ；男16例，女14例；年齡25～86歲，中位年齡為45歲；血紅蛋白濃度(Hb)(52.6±22.4)g/L；白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)(1.45±0.68)×109/L；血小板計(jì)數(shù)(PLT)(13.24±5.63)×109/L；中性粒細(xì)胞百分比(GR)(35.28±14.36)%；淋巴細(xì)胞百分比(Ly)(56.35±20.34%)；網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值(Ret)(18.38±9.15)×109/L；骨髓象分級(jí)IV級(jí)5例，V級(jí)25例。對(duì)照組30例，包括15例SAA-Ⅰ、15例SAA-Ⅱ；男14例，女16例；年齡23～88歲，中位年齡為46.5歲；血紅蛋白濃度(Hb)(50.7±23.7)g/L；白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)(1.38±0.65)×109/L；血小板計(jì)數(shù)(PLT)(14.68±7.27)×109/L；中性粒細(xì)胞百分比(GR)(33.76±15.54)%；淋巴細(xì)胞百分比(Ly)(57.62±19.37)%；網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值(Ret)(19.24±9.13)×109/L；骨髓象分級(jí)IV級(jí)4例，V級(jí)26例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

所有患者診斷均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)中重型再障診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，有其他自身免疫性疾病者、精神病患者、合并有心血管、腦血管、肝、腎和其他造血系統(tǒng)等原發(fā)疾病、懷孕及哺乳期婦女均排除在外。正常對(duì)照組共20例，均為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者，男10例，女10例，年齡22～66歲，中位年齡35.5歲。本試驗(yàn)通過南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者知情同意后進(jìn)行。

1.2 中醫(yī)證候分型標(biāo)準(zhǔn)

中醫(yī)辨證分型按照1989年6月在大連召開的中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合研究會(huì)血液病專業(yè)委員會(huì)第三屆第二次學(xué)術(shù)座談會(huì)制訂的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)[5]，結(jié)合本科室經(jīng)驗(yàn)，將治療組患者分為腎陰虛、腎陽虛、腎陰陽兩虛、熱毒雍盛4型。其臨床表現(xiàn)分別為：1)腎陰虛型：潮熱盜汗，手足心熱，面白顴紅，少寐多夢(mèng)，腰酸腿軟，心悸易驚，口干喜飲，出血色鮮，舌嫩紅苔薄少津或少苔，脈細(xì)數(shù)。2)腎陽虛型：面色白，形寒肢冷，唇甲色淡，氣短懶言，腰酸腿軟，食少便溏，出血色淡，舌胖大苔白邊有齒痕，脈沉弱。3)腎陰陽兩虛型：面色蒼白，時(shí)冷時(shí)熱，自汗盜汗，食少納呆，腰膝酸軟，遺精滑泄，舌淡苔薄白或無苔，脈沉細(xì)無力或沉細(xì)數(shù)。4)熱毒壅盛型：起病急，面色蒼白，壯熱不退或低熱持續(xù)，皮膚瘀點(diǎn)瘀斑，斑色紅紫，鼻衄齒衄，煩燥口渴，便干尿黃，頭暈乏力，舌紅苔黃，脈洪大數(shù)疾。

1.3 治療方法

1.3.1 中醫(yī)治療

血復(fù)生浸膏(5 g/包，蘇藥制字Z04001272)5 g每日3次口服。

1)腎陰虛型：血復(fù)生浸膏合左歸丸、知柏地黃丸、犀角地黃湯加減(山茱萸10 g，淮山藥20 g，黃精15 g，龜板15 g，枸杞子15 g，茯苓15 g，仙鶴草30 g，茜草15 g，陳皮10 g，知母10 g，炒黃柏10 g，丹皮15 g，水牛角片先煎15 g，生地黃15 g，炙甘草5 g)。

2)腎陽虛型：血復(fù)生浸膏合右歸丸加減(仙茅10 g，巴戟天10 g，補(bǔ)骨脂15 g，淮山藥20 g，黨參20 g，茯苓15 g，仙鶴草30 g，茜草15 g，陳皮10 g，炙甘草5 g)。

3)腎陰陽兩虛型：血復(fù)生浸膏合左歸丸、右歸丸加減(山茱萸10 g，補(bǔ)骨脂15 g，淮山藥15 g，茯苓15 g，仙鶴草30 g，茜草15 g，陳皮10 g，炙甘草5 g)。

4)熱毒壅盛型：血復(fù)生浸膏合清瘟敗毒飲、犀角地黃湯加減(水牛角片先煎30 g，生地黃15 g，丹皮15 g，赤芍15 g，生石膏先煎30 g，知母10 g，炒黃柏10 g，黃芩10 g，焦山梔子10 g，玄參10 g，白茅根30 g，板藍(lán)根15 g，連翹15 g，羚羊角粉沖服0.6 g，仙鶴草30 g，茜草15 g，陳皮10 g，甘草5 g)。

中藥復(fù)方煎劑由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥制劑中心提供，每日1劑，水煎服，早晚分服。

1.3.2 基礎(chǔ)治療

環(huán)孢素(25 mg/粒，中美華東制藥公司)5 mg/(kg·d)，分2次口服，根據(jù)血清環(huán)孢素谷濃度適當(dāng)調(diào)整環(huán)孢素用量，使其濃度達(dá)到150～250 ng/ml；十一酸睪酮(40 mg/粒，杭州默沙東制藥公司)40 mg，每日3次，口服。治療期間如合并感染加用抗生素；重度貧血者，輸注紅細(xì)胞懸液支持；出血明顯或血小板計(jì)數(shù)重度減低時(shí)加用止血藥及輸注單采血小板懸液支持。治療組采用中醫(yī)治療+基礎(chǔ)治療，對(duì)照組采用基礎(chǔ)治療。兩組均觀察6個(gè)月。

1.4 臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)

參照張之南、沈悌主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)有關(guān)再障的療效標(biāo)準(zhǔn)[4]，分為基本治愈、緩解、明顯進(jìn)步、無效。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

治療前及治療6月后分別檢測(cè)患者miRNA表達(dá)、淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平。

1.5.1 實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)

主要儀器與試劑：PCR擴(kuò)增儀(Gene Amp PCR System 9700，Applied Biosystems)，Realtime PCR儀(ViiA 7real-time PCR System，Applied Biosystems)，TRIZOL(Invitrogen life technologies)，PCR master mix(Arraystar)。

RT primers(上海百力格生物技術(shù)有限公司)：

U6：5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’；

miR-1260b5’GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATGGTG3’；

miR-155-5p：5’GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCCT3’；

實(shí)時(shí)定量PCR雙向引物序列(引物設(shè)計(jì)軟件：Primer 5.0，GSP是對(duì)應(yīng)miRNA的特異引物，R是與RT引物相匹配的引物)：

U6 F:5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’，R:5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’；

miR-155-5p GSP:5’GGGGGTAATGCTAATCGTGAT3’，R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’；

miR-1260b GSP:5'GGGCTATCCCACCACTGC3’，R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’。

檢測(cè)方法：采集靜脈血4～5 ml，EDTA抗凝，密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)，TRIzol法提取樣品RNA，并檢測(cè)RNA質(zhì)量，以U6為內(nèi)參物，進(jìn)行miRNA-155-5p、miRNA-1260b的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 40 min，85℃ 5 min；實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，40個(gè)PCR循環(huán)(95℃ 10 s，60℃ 60 s)。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

1.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群(CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+，CD19+，CD16+/CD56+)

主要儀器與試劑：采用Beckman Coulter公司Cytomics FC500流式細(xì)胞儀，淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)所用抗體(CD3+為總T淋巴細(xì)胞，CD4+CD8-為輔助T淋巴細(xì)胞，CD4-CD8+為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，CD19+為B淋巴細(xì)胞，CD3-CD16+CD56+為NK細(xì)胞)均購(gòu)自Beckman Coulter公司，自備溶血素及PBS。

標(biāo)本收集：抽取患者及健康對(duì)照者清晨空腹靜脈血2 ml，肝素抗凝。

檢測(cè)方法：外周血標(biāo)本在采集后24 h內(nèi)染色、上機(jī)檢測(cè)，取流式管，加入10 μl不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體，加入肝素抗凝的外周血100 μl混勻，室溫下避光放置20 min，加人溶血素2 ml，室溫下放置20 min，500 g離心6 min，棄去上清液，加入2 ml PBS洗滌，離心，棄上清液，500 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，分析采用Beckman Coulter 公司的CXP Analysis 分析軟件。

1.5.3 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α、TGF-β1水平

主要儀器與試劑：酶標(biāo)儀(Biotek Elx800)，人IFN-γ、IL-12p70、TNF-α、TGF-β1 ELISA試劑盒均為南京福麥斯生物公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)方法：采集EDTA抗凝外周血4 ml，2 000 rpm離心10 min，小心吸取血漿并凍存于-80℃，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12p70、TNF-α、TGF-β1，檢測(cè)方法嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床療效比較

治療組患者基本治愈0例，緩解5例，明顯進(jìn)步14例，無效11例，總有效率63.3%；對(duì)照組患者，基本治愈0例，緩解2例，明顯進(jìn)步9例，無效19例，總有效率36.7%。治療組總有效率高于對(duì)照組(P=0.039)，見表1。

表1 兩組患者臨床療效比較[n(%)]

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2 治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞microRNA表達(dá)變化情況比較

治療前SAA患者miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)均明顯升高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)，而治療前治療組和對(duì)照組相比，miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；與治療前相比，治療組治療后miRNA-1260b表達(dá)明顯下降(P<0.01)，miRNA-155-5p也有所下調(diào)(P<0.05)，對(duì)照組miRNA-1260b表達(dá)有所下調(diào)(P<0.05)，而miRNA-155-5p與治療前比較無顯著性差異(P>0.05)；治療后治療組miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.05)，而對(duì)照組miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)均高于正常對(duì)照組(P<0.01)。說明治療前SAA患者miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)均明顯升高，治療后兩者有所下降，但均未達(dá)到正常水平，治療組miRNA-155-5p、miRNA-1260b下降幅度高于對(duì)照組，結(jié)果見表2。

表2 SAA患者治療前后PBMNC miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)情況比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05,**P<0.01；與對(duì)照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群變化情況比較

與正常對(duì)照組相比，SAA患者治療前外周血Tc細(xì)胞比例明顯升高(P<0.01)，Th細(xì)胞比例、Th/Tc比值均下降(P<0.01)，NK細(xì)胞比例亦降低(P<0.05)，而總T細(xì)胞、B細(xì)胞比例與正常對(duì)照組比較則無明顯差異(P>0.05)，治療前治療組和對(duì)照組各淋巴細(xì)胞亞群比較無明顯差異(P>0.05)。與治療前相比，治療組患者治療后Tc比例下降(P<0.05)，而Th比例、Th/Tc比值、NK細(xì)胞比例則升高(P<0.05)；對(duì)照組患者治療后Tc比例有所下降，Th比例、Th/Tc比值、NK細(xì)胞比例有所升高，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后治療組患者NK細(xì)胞比例仍低于正常對(duì)照組(P<0.05)，但高于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組NK細(xì)胞比例亦低于正常對(duì)照組(P<0.05)；治療后治療組Tc細(xì)胞比例低于對(duì)照組(P<0.05)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.05)，而對(duì)照組治療后Tc比例仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)；治療后治療組Th比例仍低于正常對(duì)照組(P<0.05)，但高于對(duì)照組(P<0.05)，而對(duì)照組Th比例仍明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)；治療后治療組Th/Tc比值仍低于正常對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組則明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)。說明經(jīng)治療，SAA患者外周血Tc比例有所下降，而Th、Th/Tc、NK比例則有所升高，治療組患者變化更明顯，但尚未達(dá)正常，見表3、表4。

表3 SAA患者治療前后外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對(duì)照組比較，△P<0.05。

表4 SAA患者治療前后外周血Th細(xì)胞、Tc細(xì)胞及Th/Tc比值的比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.4 治療前后血漿細(xì)胞因子變化情況比較

治療前SAA患者血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，而TGF-β1則低于正常對(duì)照組(P<0.01)，治療組和對(duì)照組各細(xì)胞因子水平無明顯差異(P>0.05)；與治療前相比，治療后治療組血漿IFN-γ、TNF-α均明顯下降(P<0.01)，IL-12p70亦有所下降(P<0.05)，而TGF-β1則升高(P<0.01)，對(duì)照組IFN-γ、TNF-α有所下降(P<0.05)，TGF-β1升高(P<0.05)，而IL-12p70變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后與對(duì)照組相比，治療組IFN-γ、IL-12p70、TNF-α均更低(P<0.05)，而TGF-β1則高于對(duì)照組(P<0.05)；治療后與正常對(duì)照組相比，治療組IFN-γ、IL-12p70、TNF-α仍升高(P<0.05)，TGF-β1則低于正常對(duì)照組(P<0.05)，而對(duì)照組治療后IFN-γ、IL-12p70、TNF-α仍明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，TGF-β1低于正常對(duì)照組(P<0.01)。說明經(jīng)治療，SAA患者血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α均有所下降，而TGF-β1則升高，但均未達(dá)到正常水平，治療組患者治療前后細(xì)胞因子變化更明顯，見表5～6。

表5 SAA患者治療前后血漿IFN-γ、IL-12p70的比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05，**P<0.05；與對(duì)照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表6 SAA患者治療前后血漿TNF-α、TGF-β1的比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05，**P<0.05；與對(duì)照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.5 SAA患者不同變量之間相關(guān)性分析

治療前SAA患者Tc比例與IFN-γ、IL-12p70成正相關(guān)(r分別為0.631、0.574，P<0.05)，與中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)成負(fù)相關(guān)(r分別為-0.615、-0.518，P<0.05)，與血小板計(jì)數(shù)無明顯相關(guān)性； IL-12p70與IFN-γ成正相關(guān)性(r為0.628，P<0.05)，與中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)成負(fù)相關(guān)(r分別為-0.427、-0.405，P<0.05)，與血小板計(jì)數(shù)無明顯相關(guān)性，miRNA-155-5p表達(dá)與IL-12p70水平成正相關(guān)性(r為0.387，P<0.05)。

3 討論

再生障礙性貧血是一種以骨髓造血干祖細(xì)胞為靶器官的免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭性疾病。AA患者免疫功能異常，尤其是T細(xì)胞免疫功能異常在其發(fā)病過程中起重要作用。我們既往研究也表明，IFN-γ/T-bet、IL-12/ STAT4通路的異?；罨?，及Th1/Th2平衡向Th1型偏移，在AA免疫異常的發(fā)病過程中起到關(guān)鍵的作用[6]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)SAA患者存在細(xì)胞毒T細(xì)胞比例升高，輔助性T細(xì)胞比例減低，Th/Tc比值減低，造血負(fù)調(diào)控因子IFN-γ、TNF-α、IL-12p70表達(dá)均升高，而TGF-β1水平則減低，且Tc比例、IL-12p70與中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)成負(fù)相關(guān)，表明細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)在SAA發(fā)病中起到重要作用。

miRNA作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制，參與絕大多數(shù)生物過程，近年來其在免疫細(xì)胞分化發(fā)育及炎癥、自身免疫性疾病、感染、腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來越多的重視。我們前期應(yīng)用microRNA 表達(dá)譜芯片檢測(cè)再障患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)重型再障患者外周血單個(gè)核細(xì)胞存在特征性的miRNA差異表達(dá)譜，其中miR-155-5p、miR-1260b均表達(dá)上調(diào)。本研究中我們應(yīng)用realtime RT-PCR方法檢測(cè)了SAA患者miR-155-5p、miR-1260b表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果和芯片分析一致。miRNA-155是最早鑒別出來的具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)分化和免疫應(yīng)答(包括天然免疫和適應(yīng)性免疫)作用的miRNA之一。樹突狀細(xì)胞內(nèi)源性miRNA-155可促進(jìn)Th1、Th17極化細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)炎癥T細(xì)胞亞群的分化[6]，其可通過靶向抑制SOCS1表達(dá)、促進(jìn)Th1極化細(xì)胞因子IL-12分泌，從而促進(jìn)Th1細(xì)胞分化。過表達(dá)miRNA-155可顯著下調(diào)SOCS1，進(jìn)而上調(diào)IL-12及促進(jìn)Th17分化的細(xì)胞因子(IL-6、IL-23)。輔助性T細(xì)胞在TCR激活及Th極化細(xì)胞因子存在情況下可誘導(dǎo)miR-155表達(dá)。T細(xì)胞miRNA-155的表達(dá)可通過靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子Ets1—Th17分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，從而促進(jìn)Th17分化[6-7]。miR-155還能通過抑制Jarid2而促進(jìn)Th17功能[8]。miR-155缺陷的Th17細(xì)胞對(duì)于IL-23刺激呈低反應(yīng)性，提示miR-155在致病性Th17發(fā)揮效應(yīng)功能時(shí)起重要調(diào)節(jié)作用[7]。miRNA-155包括miRNA-155-5p和miRNA-155-3p兩個(gè)亞型，目前已證實(shí)miRNA-155-5p在免疫反應(yīng)、炎癥、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮了重要的作用[9]。本研究中相關(guān)性分析表明miRNA-155-5p表達(dá)與IL-12p70水平成正相關(guān)性，因而AA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-155-5p升高可能在AATh1/Th17極化激活的免疫發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。miRNA-1260b目前被認(rèn)為具有類似于癌基因的功能，它可抑制Wnt信號(hào)通路相關(guān)具有抑癌作用的基因，如SFRP1、Dkk2及Smad4，從而促進(jìn)腎細(xì)胞癌的進(jìn)展[10]，此外在前列腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌中miRNA-1260b高表達(dá)也與腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展、預(yù)后差關(guān)系密切[11-13]。生物信息學(xué)分析表明，miRNA-1260b和miRNA-155-5p兩者預(yù)測(cè)作用的靶基因均包括ETS1。Ets1轉(zhuǎn)錄因子是Ets基因家族的一種，在進(jìn)化過程中高度保守，在免疫細(xì)胞分化發(fā)育、功能調(diào)節(jié)、自身免疫性疾病發(fā)生及腫瘤侵襲過程中具有重要作用。我們研究表明，AA患者高表達(dá)miRNA-155-5p和miRNA-1260b，miRNA-1260b可能與miRNA-155-5p協(xié)同作用，通過抑制ETS1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Th17的分化，在AA發(fā)病過程中發(fā)揮作用。

重型再障根據(jù)其臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)學(xué)“髓勞”“虛勞”“血虛”“血證”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病因病機(jī)是在外感六淫、內(nèi)傷七情、飲食不節(jié)、勞倦過度、藥物毒邪等因素的作用下，傷及臟腑陰陽，尤其是腎，因腎藏精主骨生髓，精血之化生、骨髓的正常功能均與腎關(guān)系密切。對(duì)于重型再障中醫(yī)辨證分型，可分為腎陰虛型、腎陽虛型、腎陰陽兩虛型、熱毒雍盛型及陰虛火旺型。由于腎陰虛型患者和陰虛火旺型患者臨床表現(xiàn)及用藥較為相似，我們將這兩型合并為同一組。而腎精虧虛則貫穿再障發(fā)病的始末，目前中醫(yī)藥聯(lián)合環(huán)孢素、雄激素是國(guó)內(nèi)公認(rèn)的治療再障有效、安全的方法。本研究中SAA患者采用血復(fù)生浸膏為主治療后，血象改善、病情好轉(zhuǎn)，療效優(yōu)于單純西藥對(duì)照組，Tc比例、IFN-γ、IL-12p70、TNF-α水平下降，Th比例、Th/Tc比值、NK細(xì)胞比例、TGF-β1升高，且miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達(dá)均下調(diào)，上述指標(biāo)變化幅度均比單純西藥治療組更明顯，提示血復(fù)生浸膏為主聯(lián)合辨證治療再障、調(diào)控再障免疫異常的機(jī)理部分是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、抑制造血負(fù)調(diào)控因子、下調(diào)miRNA-155-5p、miRNA-1260b來實(shí)現(xiàn)的。

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EffectsofXuefushengExtractumCombinedwithTreatmentBasedonSyndromeDifferentiationinSAAPatients:StudyofChangesofPeripheralBloodmicroRNA,LymphocyteSubsetsandCytokines

LI Jun, CHEN Jie, SUN Xue-mei, ZHU Xue-jun, JIANG Peng-jun, CHEN Jian-yi,NI Hai-wen, ZHANG Wen-xi, XIA Wen

(TheAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,JiangsuTCMHospital,Nanjing210029,China)

Objective: To study the effects of Xuefusheng extractum on peripheral blood microRNA, lymphocyte subsets and cytokines in severe aplastic anemia(SAA) patients. Methods: 60 Patients were randomly divided into the observation group(n=30) and the control group(n=30). The observation group was treated with TCM treatment plus basic treatment; whereas, the control group was only given basic treatment. TCM treatment included administration of Xuefusheng extractum combined with treatment based on syndrome differentiation. On the basis of Xuefusheng extractum, modified Zuogui pill, Zhibai Dihuang pill and Xijiao Dihuang decoction were also administrated to the patients with Kidney-yin deficiency; modified Yougui pill was also given to the patients with Kidney-yang deficiency; modified Zuogui pill and Yougui pill were also applied to the patients with deficiency of both Kidney-yin and Kidney-yang; and modified Qingwen Baidu decoction and Xijiao Dihuang decoction were also given to the patients with excessive toxic-heat. The basic treatment included the applications of cyclosporine, eleven acid testosterone, blood transfusion, and other support treatment. Both groups were treated for six months. Expressions of miRNA-155-5p and miRNA-1260b in peripheral blood mononuclear cells(PBMNC) were detected with RT-PCR before and after the treatment, levels of IFN-γ, IL-12p70, TNF-α and TGF-β1 were tested with ELISA method and flow cytometry before and after the treatment. Results: The total effective rate of the observation group was higher than that of the control group(63.3% Vs 36.7%,P=0.039). Before the treatment, expressions of miRNA-155-5p and miRNA-1260b, Tc proportion, plasma levels of IFN-γ, IL-12p70 and TNF-α were significantly higher in CAA patients compared to those in normal people(P<0.01); whereas, Th proportion, Th/Tc ratio and TGF-β1 level were lower than those of normal people(P<0.01). After six-month treatment, in the observation group, expression of miRNA-1260b, levels of IFN-γ and TNF-α were significantly decreased (P<0.01); expression of miRNA-155-5p, Tc proportion and IL-12p70 were also decreased(P<0.05); TGF-β1 level were significantly increased(P<0.01). Th proportion, Th/Tc ratio and NK proportion were also increased(P<0.05). However, these indicators had not yet reached the normal level. The indexes of the treatment group changed more significantly than those of the control group. Conclusion: The up-regulation of miRNA-155-5p and miRNA-1260b, cellular immune hyperfunction and disorder of hematopoiesis regulating factors play important roles in the immune abnormalities in SAA patients. Therapeutic effect of treating SAA with Xuefusheng extractum and treatment based on syndrome differentiation is superior to that of simple western medicine treatment. The therapeutic mechanism includes down-regulation of miRNA-155-5p and miRNA-1260b, improving lymphocyte subsets imbalance and disorder of cytokines, and alleviating abnormal hyperfunction of cellular immune response and hematopoietic suppression.

Severe aplastic anemia; microRNA; Lymphocyte subsets; Cytokine; Xuefusheng extractum

R285.6

A

1002-2406(2017)06-0077-07

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.BK20131034)；2015年江蘇省政府留學(xué)獎(jiǎng)學(xué)金資助項(xiàng)目(No.蘇教外[2015]44號(hào))；2016年江蘇省衛(wèi)生國(guó)際(地區(qū))交流支撐計(jì)劃青年醫(yī)師自選項(xiàng)目(No.蘇衛(wèi)國(guó)合(2016)155號(hào))

李峻(1981-)，男，副主任醫(yī)師，講師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事中西醫(yī)診治血液病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究工作。

2017-05-03

修回日期：2017-05-25