劉影哲，林潔，潘祥賓

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

白虎加人參湯對糖尿病模型大鼠TRPA1通道基因表達的影響

劉影哲1，林潔1，潘祥賓2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：探討白虎加人參湯對糖尿病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)下血清丙二醛及背神經(jīng)根TRPA1mRNA表達的影響。方法：腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備糖尿病大鼠模型，實驗分為白虎加人參湯組、α-硫辛酸組、模型對照組及空白對照組。ELISA法測定大鼠血清MDA含量，RT-PCR法檢測TRPA1mRNA表達水平。結(jié)果：白虎加人參湯和α-硫辛酸組大鼠血清MDA水平與模型對照組比較均有所下降(P<0.01)，但兩組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。白虎加人參湯組、α-硫辛酸組Drg中TRPA1mRNA的表達均下降，但中藥組下調(diào)作用更明顯，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論：白虎加人參湯能降低糖尿病模型大鼠血清MDA的含量，并下調(diào)Drg中TRPA1mRNA的表達,對糖尿病神經(jīng)病變有一定的防治作用。

白虎加人參湯；糖尿??；MDA；TRPA1

隨著糖尿病發(fā)病率的持續(xù)增高，其并發(fā)癥導(dǎo)致的致殘率及致死率增高成為了醫(yī)患關(guān)注的重點。糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)引起的冷、麻、熱、痛等感覺異常癥狀嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。瞬時感受器電位基因超家族(TRP)的發(fā)現(xiàn)，為感覺異常疾病，特別是本病的研究提供了廣闊的空間，其調(diào)控的冷、熱、痛感覺異常即為本病的發(fā)病特征。本實驗研究白虎加人參湯對糖尿病大鼠背神經(jīng)根中TRPA1mRNA表達的影響，為DPN的臨床治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心購買45只清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(220±10)g，許可證號：SCXK(黑)2013-004。

1.1.2 主要藥物及試劑

白虎加人參湯由石膏、知母、甘草、粳米、人參組成(均購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)；α-硫辛酸注射液(重慶藥友制藥有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；丙二醛(MDA)試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Real-time PCR 試劑盒(TaKaRa公司 code DRR420A)。

TRPA1-F引物序列(5′to3′)GCGTCTTGGTTTTGCAGCTC;TRPA1-R,ACCGTCCTTTTGCCAGTTCC;βactin-F,ACTCTGTGTGGATTGGTGGC;βactin-R,AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC，以上引物均購于TaKaRa公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備與實驗分組

45只SD大鼠隨機選取10只作為空白對照組，余下禁食12 h后腹腔注射STZ 50 mg/kg，72 h后給予尾靜脈采血，檢測血糖數(shù)值。將血糖≥16.7 mmol/L的31只模型成功大鼠隨機分成模型對照組、白虎加人參湯組和α-硫辛酸組。分別給予中藥9.38 g/(kg·d)及α-硫辛酸20 mg/(kg·d)灌服8周；模型對照組和空白對照組給予同體積生理鹽水。

1.2.2 觀察指標

1)一般情況觀察；2)測定丙二醛(MDA)；3)檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPA1mRNA的基因表達。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)比較

空白對照組大鼠一般狀況較好,模型對照組逐漸出現(xiàn)精神萎靡，并有個別大鼠出現(xiàn)足部潰爛及眼球變白等現(xiàn)象。白虎加人參湯組和α-硫辛酸組大鼠狀態(tài)介于兩組之間。實驗周期內(nèi)，空白組大鼠死亡1只；模型組死亡3只，白虎加人參湯組死亡2只，α-硫辛酸組死亡3只。

2.2 血清MDA含量比較

表1可見，與空白對照組比較，各組大鼠血清MDA水平明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；白虎加人參湯組和α-硫辛酸組與模型對照組比較，大鼠血清MDA水平均有下降(P<0.01)，兩組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 血清MDA水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，□P<0.01；與α-硫辛酸組比較，■P>0.05。

2.3 大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPA1mRNA基因表達情況

結(jié)果見表2與圖1。模型組、白虎加人參湯組和α-硫辛酸組與空白組相比較，TRPA1mRNA的表達均升高(P<0.01)；與模型對照組比較，白虎加人參湯組和α-硫辛酸組TRPA1mRNA的表達均下降(P<0.05)；白虎加人參湯組TRPA1mRNA表達水平下降更明顯，與α-硫辛酸組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 TRPA1mRNA電泳圖注：Lane 1、2、3為模型組電泳帶；Lane 4、5、6為空白組電泳帶；Lane 7、8、9為硫辛酸組電泳帶；Lane 10、11、12為白虎加人參湯組電泳帶。

組別nTRPA1mRNA空白對照組31．01±0．01模型對照組32．07±0．52?白虎加人參湯組31．46±0．23?□■α-硫辛酸組31．55±0．45?□

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，□P<0.05；與α-硫辛酸組比較，■P<0.05。

3 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)的發(fā)病率已達到60～90%[1]。除了微循環(huán)障礙和血管損傷學(xué)說，大量證據(jù)表明神經(jīng)元功能的特殊改變是DPN的主要機制，而且在糖尿病初期即已存在，只是其臨床表現(xiàn)不明顯，易被人們所忽視，當出現(xiàn)涼、麻、痛等表現(xiàn)時，患者神經(jīng)損傷已經(jīng)很嚴重,嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。因此，早期防治本病,延緩病情發(fā)展至關(guān)重要[2]。白虎加人參湯方出自《傷寒論》第222條“若渴欲飲水，口干舌燥者，白虎加人參湯主之”，是治療糖尿病初期的代表方劑之一。目前針對白虎加人參湯的實驗研究多從血糖[3]、血脂等指標入手，闡述其保護胰島功能和減輕胰島素抵抗的作用機制，對其并發(fā)癥的治療機制多從抗氧化應(yīng)激入手進行深入闡述，并證實了其可提高糖尿病大鼠的痛閾值，提高坐骨神經(jīng)的傳導(dǎo)速度，同時具有改善神經(jīng)纖維和髓鞘變性[4]等作用。

多項糖尿病神經(jīng)病變的研究已證實，TRP離子通道對于調(diào)控冷、熱、痛感覺異常起著關(guān)鍵的作用。TRPA1通道可被低溫及氧自由基等因素激活，研究已證實在溫度低于17℃的時候TRPA1通道被激活[5]，產(chǎn)生冷痛覺及神經(jīng)源性疼痛和超敏反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn),TRPA1確實參與了炎癥或神經(jīng)損傷后的冷痛感覺[6-7]。在糖尿病神經(jīng)病變和化療藥物引起的外周神經(jīng)病變等研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TRPA1通道的介導(dǎo)作用尤為明確[8-9]。Serena[10]指出,冷刺激介導(dǎo)的疼痛僅與TRPA1相關(guān)，并且明確了在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可發(fā)揮作用。隨著糖尿病并發(fā)癥的加重，機體的寒熱狀態(tài)一直處于動態(tài)演變，白虎加人參湯可對機體的寒熱進行調(diào)控，與TRP離子通道的作用機制異曲同工，故我們從TRP離子通道入手，探討白虎加人參湯治療糖尿病及其并發(fā)癥的作用機制，系對中醫(yī)藥異病同治，未病防變理論的深入的闡述。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會慢性并發(fā)癥調(diào)查組.1991～2000年全國住院糖尿病患者慢性并發(fā)癥及相關(guān)大血管病變回顧性分析[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2002,24(5):447-451.

[2] 王宏偉，冷錦紅.糖尿病周圍神經(jīng)病變的中醫(yī)藥治療研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2017,34(4):124-128.

[3] 賴潔梅,朱賤香.白虎加人參湯對 2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2014,25(6):683-687.

[4] 王璞,王聿成.白虎加人參湯干預(yù)糖代謝及糖尿病并發(fā)癥的實驗研究進展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,19(10)：67-68.

[5] Jaquemard D,Schenker T,Trueb B,et al. An ankyrin-like protein withtransmembrane domains is specifically lost after oncogenic transformation of human fibroblasts[J].J Biol Chem,1999,274(11):7325-7333.

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[9] 馮昌盛,黃宇光.疼痛離子通道TRPA1研究進展[J].華西醫(yī)學(xué),2011,26(1):146-148.

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TRPA1mRNAExpressioninDMRatsTreatedwithBaihuRenshenDecoction

LIU Ying-zhe1, LIN Jie1, PAN Xiang-bin2*

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective: To investigate the impact of Baihu Renshen decoction on the expressions of MDA and TRPA1mRNA under oxidative stress in DM(diabetes mellitus) rats. Methods: DM models were established by injecting STZ. DM rats were randomly divided into the Chinese medication group, the western medication group, the model group and the blank control group. The Chinese medication group was treated with Baihu Renshen decoction, and the western medication group was given alpha lipoic acid. The content of MDA was determined with ELISA method, and the expressions of TRPA1mRNA was detected by RT-PCR. Results: The MDA levels of the medication groups were both significantly decreased compared to those of the model group(P<0.01), but there was no statistical difference between the two medication groups(P>0.05). The expression of TRPA1mRNA in the medication groups were decreased, of which the Chinese medication group was more obvious(P<0.05). Conclusion: Baihu Renshen decoction can reduce the content of MDA in DM rats, and decrease the expression of TRPA1mRNA, it has some protective effect on diabetic neuropathy.

Baihu Renshen decoction; DM; MDA;TRPA1

R285.5

A

1002-2406(2017)06-0038-03

黑龍江省教育廳基金項目(No.12521508)；黑龍江省自然科學(xué)基金項目(No．H201314)

劉影哲(1977-)，女，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病分子機制的研究。

潘祥賓*(1976-),男，副主任醫(yī)師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病作用機制研究。

2017-03-10

修回日期：2017-04-11