肖佳音，王春雨，李慶忠

(黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，黑龍江 哈爾濱 150088)

刺五加膏遺傳毒性和致畸作用實驗研究

肖佳音，王春雨，李慶忠*

(黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，黑龍江 哈爾濱 150088)

目的：對刺五加膏進行遺傳毒性及致畸作用評價，為其臨床應(yīng)用開發(fā)提供安全性試驗依據(jù)。方法：采用小鼠睪丸染色體畸變試驗、哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗、致畸試驗來對刺五加膏進行評價。結(jié)果：當(dāng)劑量為10.0、5.0、2.5 g/kg時，在小鼠睪丸染色體畸變試驗中染色體結(jié)構(gòu)畸變率分別為0.2%、0.4%、0%，早熟分離率分別為0%、0%、0.2%，互相異位率均為0%；哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗中染色體數(shù)目變化畸形率分別為0.3%、0.1%、0%，結(jié)構(gòu)變化畸變率分別為0.8%、0.7%、0.7%。當(dāng)劑量為7.5、3.75、1.875 g/kg時，致畸試驗對孕鼠的體質(zhì)量增長、孕鼠的胚胎毒性及對胎鼠生長發(fā)育、胎仔的內(nèi)臟及骨骼均無明顯異變。三項試驗結(jié)果均與溶媒對照組接近，結(jié)果顯示陰性。結(jié)論：在本實驗條件和劑量下，刺五加膏未見遺傳毒性作用及致畸作用。

刺五加膏；遺傳毒性；致畸作用

刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxin.)Hams]為多年生硬質(zhì)灌木。具有補益肝腎，添精補髓，強壯筋骨之功效，用于緩解肝腎虧虛所致的暫時性腦缺血發(fā)作、腦動脈硬化及腦血栓形成,還可用于治療冠心病、心絞痛兼有神經(jīng)官能癥及更年期綜合征，對于應(yīng)激導(dǎo)致的病理生理變化及炎癥均有較好的療效[1]。刺五加膏為刺五加經(jīng)加工制成的浸膏，益氣健脾，補腎安神，用于脾腎陽虛，體虛乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多夢。本實驗通過對刺五加膏進行遺傳毒性及致畸作用的研究，評價其遺傳毒性，為其臨床應(yīng)用開發(fā)提供安全性試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品

刺五加膏由黑龍江省食品藥品檢驗檢測所提供，為紅褐色浸膏，規(guī)格為120 g/支，每次1.5 g，每日3次，陰涼干燥處保存。其人體推薦服用劑量為4.5 g/(60 kg·d)。本品為紅褐色浸膏狀物質(zhì)，試驗時以蒸餾水作為溶媒稀釋后使用。

1.2 實驗動物

清潔級KM種小鼠及Wistar大鼠由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK(吉)2011-0004。飼料由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK(吉)2010-0001。飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級實驗室，許可證號：SYXK(黑)2014004，溫度(23±2)℃，濕度(55±10)%。

1.3 劑量選擇與受試物給予方式

1.3.1 小鼠睪丸染色體畸變試驗

采用經(jīng)口灌胃方式給予受試物，設(shè)10.0、5.0、2.5 g/kg三個劑量組，另設(shè)溶媒對照組和環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)陽性對照組，各組給藥體積均為均為20 mL/kg。

1.3.2 哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗

采用經(jīng)口灌胃方式給予受試物，設(shè)10.0、5.0、2.5 g/kg三個劑量組，另設(shè)溶媒對照組和環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)陽性對照組，各組灌胃量均為20 mL/kg。

1.3.3 致畸試驗

灌胃給予受試物，分別設(shè)7.5 g/(kg·d) (高劑量組，相當(dāng)于人體推薦量100倍)、3.75 g/(kg·d)(中劑量組，相當(dāng)于人體推薦量的50倍)、1.875 g/(kg·d)(低劑量組，相當(dāng)于人體推薦量的25倍)劑量組，另設(shè)溶媒對照組和環(huán)磷酰胺20 mg/(kg·d)陽性對照組，各組給藥體積均為10 mL/kg。

1.4 主要儀器與試劑

1.4.1 儀器

生物顯微鏡(Olympus公司，BX53)；變焦體視顯微鏡(Olympus公司，SZX7)；離心機(Sigma公司，2-6)；電子天平(METTLER公司，AL204)；電子天平(德國sartorius公司，BSA2201)。

1.4.2 試劑

環(huán)磷酰胺(Sigma公司，批號120M1253V)；秋水仙素(aladdin Chemistry Co.Ltd，批號34723)；Giemsa染液(Sigma公司，批號BCBF9150)；氯化鈉注射液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號110723A9)。

1.5 試驗方法

1.5.1 小鼠睪丸染色體畸變試驗[2]

取上述小鼠25只，按體質(zhì)量隨機分成5組，每組5只，分為受試樣品高、中、低劑量組、溶媒對照組及陽性對照組。受試樣品高、中、低劑量組分別灌胃給予刺五加膏10、5、2.5 g/kg，溶媒對照組灌胃給予等體積蒸餾水，灌胃體積20 mL/kg。陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg，注射體積20 mL/kg。各組均每天給藥1次，連續(xù)5天。第一次給藥后14天腹腔注射秋水仙素6 mg/kg，注射體積10 mL/kg，注射后6 h每組取5只存活小鼠頸椎脫臼處死，取雙側(cè)睪丸分離曲細(xì)精管，低滲、固定、制片、Giemsa 染色。每只動物分析100個中期分裂相的初級精母細(xì)胞，觀察項目包括染色體結(jié)構(gòu)改變(斷裂、裂隙、微小體)、相互易位、X-Y和常染色體的單價體(早熟分離)。

1.5.2 哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗[2-3]

取上述小鼠50只，雌雄各半，按性別、體質(zhì)量隨機分成5組，每組10只，分為受試樣品高、中、低劑量組、溶媒對照組及陽性對照組。受試樣品高、中、低劑量組分別灌胃給予刺五加膏10、5、2.5 g/kg，陽性對照組灌胃給予環(huán)磷酰胺40 mg/kg，溶媒對照組灌胃給予等體積蒸餾水，灌胃體積20 mL/kg。各組每天給藥1次(間隔24 h)，連續(xù)給藥4次，末次給藥后24 h小鼠頸椎脫臼處死。處死前4 h腹腔注射秋水仙素4 mg/kg。處死小鼠后取股骨以2.2%檸檬酸鈉溶液反復(fù)沖洗骨髓，離心、制片、Giemsa 染色，每只動物分析100個中期相細(xì)胞。觀察項目包括染色體數(shù)目改變、染色體結(jié)構(gòu)改變。

1.5.3 致畸試驗[4]

將性成熟雌、雄大鼠按2∶1同籠過夜，每日早晨觀察陰栓，查出陰栓認(rèn)為該鼠已交配，當(dāng)日作為“受孕”0天。如果5天內(nèi)未交配，應(yīng)更換雄鼠。檢出的“孕鼠”分為5組，每組12只，分別為溶媒對照組給予等體積蒸餾水，低劑量組1.875 g/kg，中劑量組3.75 g/kg，高劑量組7.5 g/kg和陽性對照組環(huán)磷酰胺20 mg/kg。陽性對照組于孕期第11天一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺10 mL/kg，其余各組于受孕的第7～16天，灌胃給藥，給藥體積10 mL/kg，溶媒對照組給予同體積的蒸餾水，受孕的0、7、12、16、20天稱體質(zhì)量。于大鼠受孕第20天直接斷頭處死。剖腹取出子宮稱重，記錄并檢查吸收胎、死胎及活胎數(shù)。記錄胎仔的性別、體質(zhì)量、身長、檢查胎鼠外觀有無異常。每窩取一半胎仔用Bouin液固定，徒手切片法檢查內(nèi)臟，另一半胎仔用茜素紅染色，檢查骨骼。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及結(jié)果判定

按衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)規(guī)定，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，對各試驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析并判定試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 刺五加膏小鼠睪丸染色體畸變試驗

表1可見，與溶媒對照組比較，刺五加膏高、中、低劑量組小鼠睪丸染色體畸變率差別均無統(tǒng)計學(xué)意義;陽性對照組小鼠睪丸染色體畸變率差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗

表2可見，與溶媒對照組比較，刺五加膏高、中、低劑量組骨髓細(xì)胞染色體畸變率差別均無統(tǒng)計學(xué)意義;陽性對照組骨髓細(xì)胞染色體畸變率差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 小鼠睪丸染色體畸變試驗結(jié)果

表2 最后一次給藥后24 h小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗結(jié)果

2.3 致畸試驗

由表3～6可知，刺五加膏各劑量組對孕鼠的體質(zhì)量增長與溶媒對照組相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對孕鼠的胚胎毒性及對胎鼠生長發(fā)育的影響，與溶媒對照組相比，差別亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。胎仔的內(nèi)臟及骨骼的檢查結(jié)果表明，刺五加膏各劑量組對胎仔的內(nèi)臟及骨骼均無明顯異變，與溶媒對照組相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 刺五加膏對孕鼠不同天數(shù)體質(zhì)量增長的影響

注：與溶媒對照組比較，*P>0.05。

表4 刺五加膏對孕鼠體質(zhì)量增重的影響

注：與溶媒對照組比較，*P>0.05。

表5 刺五加膏對孕鼠胚胎毒性的影響

注：與溶媒對照組比較，*P>0.05。

表6 刺五加膏對胎鼠生長發(fā)育的影響

注：與溶媒對照組比較，*P>0.05。

3 討論

刺五加作為中藥歷史悠久,應(yīng)用廣泛，在歷代本草均有記載，具有益氣健脾、補益安神、益精壯骨之功效?！侗静菥V目》稱刺五加為“本經(jīng)上品”，能“補中益氣，堅筋骨強意志，久服輕身耐老”。近年來研究表明，刺五加具有抗焦慮癥的藥理作用。刺五加膏以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，中藥刺五加為原料，采用現(xiàn)代工藝加工而成，具有益氣健脾，補腎安神之功，用于脾腎陽虛，體虛乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多夢。

本實驗從小鼠睪丸染色體畸變試驗、哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗、 致畸試驗三項試驗作為切入點，其目的是為安全性評價提供資料、降低使用風(fēng)險。在三項試驗中，刺五加膏高、中、低劑量組與溶媒對照組無差別，按照衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進行評價，證實在本實驗條件和劑量下，刺五加膏未見遺傳毒性及致畸作用。

[1] 趙丹江.刺五加的藥用價值[J].中醫(yī)藥信息,2011,28(5):115-117.

[2] 梁婕,張穎,俞萍,等.楊梅花青素的安全性評價研究[J].環(huán)境與健康雜志,2016,33(9):820-823.

[3] 齊彥,王瑤,郭麗新,等.樺菌芝多糖的抗突變作用研究[J].中醫(yī)藥信息,2011,28(1):21-23.

[4] 郭艷,蘭真,曾凡駿,等.趕黃草的安全性毒理學(xué)評價研究[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志,2016,32(5):476-481.

StudyonGeneticToxicityandTeratogenicityofAcanthopanaxSenticosus

XIAO Jia-yin, WANG Chun-yu, LI Qing-zhong*

(HeilongjiangInstituteforFoodandDrugControl,Harbin150088,China)

Objective:To study genetic toxicity and teratogenicity ofAcanthopanaxsenticosusand to provide safety testing basis for clinical application. Methods: This research adopted the mice testicle chromosome aberration test, bone marrow cell chromosome aberration test, and teratogenic test to evaluate genetic toxicity and teratogenicity of Acanthopanax senticosus ointment. Results: When the dose was 10.0, 5.0, 2.5 g/kg, the chromosome structure distortion rates were 0.2%, 0.4% and 0% respectively, premature separation rates were 0%, 0% and 0.2% respectively, ectopic rates were all 0%; Chromosome deformity were 0.3%, 0.1% and 0% respectively, in bone marrow cell chromosome aberration test, structural change aberration rates were 0.8%, 0.7% and 0.7% respectively. When the dose was 7.5, 3.75, 1.875 g/kg, teratogenic test showed that weight gain of pregnant rats, pregnant rat embryo toxicity, was the growth and development of fetal rats,and embryo of internal organs and bone were not aberrant.Conclusion: Under this experimental condition,Acanthopanaxsenticosusointment does not show genetic toxicity and teratogenicity.

Acanthopanaxsenticosusointment;Genetic toxicity;Teratogenication

R28

A

1002-2406(2017)06-0035-03

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(No. 12541259)

肖佳音(1978-)，女，博士，副主任藥師，主要研究方向：藥檢藥理，藥品、保健食品及化妝品安全性評價。

李慶忠*(1962-)，男，主任藥師，主要研究方向：藥品、食品，醫(yī)療器械、藥包材安全性評價。

2017-03-21

修回日期：2017-04-10