何則平+高楊+王銳

【摘要】 目的：從離體細胞水平觀察miRNA-133b-3p調(diào)控P2rx4表達對神經(jīng)元鈣活動的影響。方法：用轉(zhuǎn)染試劑將miRNA-133b-3p mimic和miRNA-133b-3p inhibitor轉(zhuǎn)入PC12細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，用熒光定量PCR的方法檢測PC12細胞中miRNA-133b-3p的含量，P2rx4 mRNA的表達變化；用免疫印跡的方法檢測P2rx4受體蛋白的表達變化；用胞內(nèi)鈣成像技術(shù)檢測ATP孵育后細胞中鈣離子濃度的變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染48 h后，與陰性對照組相比，加入miRNA-133b-3p mimic后PC12細胞中miRNA-133b-3p的含量明顯增加，P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表達減少，ATP孵育后細胞中鈣離子濃度的升高明顯減弱。轉(zhuǎn)染inhibitor后，細胞內(nèi)miRNA-133b-3p的含量明顯減少，P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表達增加，ATP孵育后胞內(nèi)鈣離子濃度的升高明顯增強。結(jié)論：miRNA-133b-3p通過負向調(diào)控P2rx4的表達來影響細胞鈣活動。

【關(guān)鍵詞】 PC12細胞； miRNA-133b-3p； P2rx4； 鈣活動； 表達調(diào)控

【Abstract】 Objective：To observe the effect of miRNA-133b-3p on the calcium mobilization of neurons by regulating the expression of P2rx4.Method：Transfection reagents and miRNA-133b-3p mimic or inhibitor were added into the culture medium of PC12 cell.After 48 hours of transfection，the expression of miRNA-133b-3p

and P2rx4 mRNA were measured by real-time PCR.Western blot method was used for quantitative analysis on P2rx4 protein.The mobilization of intracellular calcium was measured with calcium imaging technique.Result：After 48 hours of transfection，compared with the negative control group，after adding miRNA-133b-3p mimic，the expression of miRNA-133b-3p in PC12 cells was significantly increased， the expressions of P2rx4 mRNA and P2rx4 protein were significantly decreased，and calcium ion concentration increase induced by ATP was decreased obviously.After adding miRNA-133b-3p inhibitor，the expression of miRNA-133b-3p was decreased significantly，and the expressions of P2rx4 mRNA and P2rx4 protein were significantly increased，the calcium ion concentration increase induced by ATP was enhanced obviously.Conclusion：miRNA-133b-3p downregulation of P2rx4 affectes intracellular calcium activity and is involved in chronic pain.

【Key words】 PC12 cell； miRNA-133b-3p； P2rx4； Calcium mobilization； Regulation of expression

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.006

疼痛是大多數(shù)疾病共有的癥狀，慢性疼痛及嚴(yán)重疼痛已經(jīng)構(gòu)成一個單獨的疾病[1]。不同類型疼痛的共同過程主要包括痛刺激對傷害性感受器的激活，傷害性信息的傳遞，痛信息在不同中樞的處理，并最終產(chǎn)生痛覺[2-3]。在這個過程發(fā)揮最基本、最重要作用的因素是各種痛相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，探討不同條件下痛相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生以及表達調(diào)控是疼痛尤其是慢性疼痛機制研究中最有可能獲得具有應(yīng)用價值成果的領(lǐng)域。

microRNA（miRNA）是一類單鏈非編碼RNA，可以對基因組的大部分進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[4]。哺乳動物體內(nèi)超過60%的基因是miRNAs的靶基因，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達，在疼痛信號產(chǎn)生與傳遞過程發(fā)揮了重要作用[5]。課題組在前期工作中，利用miRNA芯片，初步明確了CFA致大鼠慢性炎性疼痛模型DRG中miRNAs的表達譜。綜合多個生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，得到

22種與疼痛有關(guān)的靶基因，并從中篩選出已知與疼痛形成密切相關(guān)的P2rx4。

P2rx4基因編碼的蛋白是P2X4受體，P2X4受體是疼痛遞質(zhì)ATP的受體之一，與痛覺調(diào)制密切相關(guān)[6-7]。生物信息學(xué)的分析結(jié)果提示P2rx4可能受3個差異表達miRNA調(diào)控。采用雙熒光素酶報告基因法對P2rx4和3個差異表達的miRNA進行了靶結(jié)合實驗，最后證實P2rx4的mRNA只與miRNA-133b-3p發(fā)生了結(jié)合。endprint

前期的在體的研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)miRNA-133b-3p與P2rx4之間可能存在負相關(guān)關(guān)系。提示miRNA-133b-3p可能通過調(diào)節(jié)P2rx4的表達來調(diào)控疼痛的發(fā)展變化。P2X4是ATP門控的離子通道（Ca2+通道），因此在本研究中筆者采用高分化型的雄性大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12，在細胞水平外源性的干預(yù)miRNA-133b-3p的表達，觀察miRNA-133b-3p對P2rx4 mRNA和蛋白表達的調(diào)控作用以及該調(diào)控作用對ATP孵育后細胞鈣活動的影響，最終證實miRNA-133b-3p可通過調(diào)控P2X4受體的表達，進而影響神經(jīng)元的鈣活動以及慢性疼痛的發(fā)生?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 分組 將PC12細胞分四組：Mimic組、Mimic陰性對照組（NCM組）、Inhibitor組、Inhibitor陰性對照組（NCI組）。

1.2 轉(zhuǎn)染 細胞按每皿3×106/mL的密度接種。轉(zhuǎn)染按riboFECTTM說明書轉(zhuǎn)染。mimic和inhibitor的終濃度分別為100、150 nM。

1.3 鈣離子成像 每皿加入500 μL Fura 2-AM工作液，孵育20 min，洗滌三次；加入任氏液孵育10 min，用MetaFlour系統(tǒng)記錄熒光強度的變化。記錄基線2 min，加入2 μM ATP，記錄3 min，至熒光強度回到基線水平后，再加入16 μM的ATP，記錄2 min。

1.4 實時熒光定量PCR 用miRNeasy Mini Kit試劑盒（Qiagen）來抽提細胞中的總RNA。用miScript? Ⅱ RT Kit試劑盒（Qiagen），將RNA溶液反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，U6作為內(nèi)參，用miScript SYBR? Green PCR Kit試劑盒（TaKaRa）檢測miRNA-133b-3p的表達。用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa），將RNA溶液反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以大鼠的β-actin為內(nèi)參，用SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（TaKaRa）檢測P2rx1-7 mRNA的表達量。

1.5 蛋白印跡 裂解細胞，提取蛋白。檢測蛋白濃度，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離總蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。封閉1 h，漂洗，P2rx4兔一抗（1∶500，Abcam）孵育過夜。山羊抗兔HRP-IgG（1∶3000，生工）孵育1 h，凝膠成像儀成像。用蛋白印跡膜再生液洗脫已經(jīng)結(jié)合的一抗和二抗，孵育GAPDH（1∶1000，生工）一抗，用內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化P2rx4蛋白的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料且符合正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P2rx4在PC12細胞鈣活動中的作用觀察 P2rx有P2rx1～P2rx7七種亞型，qPCR檢測其表達。與P2rx1相比，其中P2rx4在PC12細胞中的相對表達量最高（P<0.01），見圖1A。向PC12細胞中分別加入P2XR受體的激動劑和抑制劑（10 ?M IVE，2 ?M PPAD，2 ?M 5BDBD）。其中IVE是P2rx4的激動劑，PPADs是P2XR（P2rx1、P2rx2、P2rx3、P2rx5）的拮抗劑，5BDBD是P2rx4的拮抗劑。鈣成像結(jié)果顯示：與ATP組（0.449 00±0.020 92）相比，IVE組鈣離子濃度明顯增加（0.651 30±0.027 46，P<0.01）；5BDBD組鈣離子濃度明顯降低（0.256 10±0.026 29，P<0.01）；PPADs組鈣離子濃度明顯減少（0.256 10±0.026 29，P<0.01）；PPADs+5BDBD組鈣離子濃度明顯降低（0.096 97±0.016 60，P<0.01）。見圖1B。

2.2 轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p mimic對PC12細胞的影響 轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p mimic 48 h后，檢測miRNA-133b-3p的相對含量，P2rx4 mRNA和蛋白的表達變化，以及細胞內(nèi)鈣活動。結(jié)果顯示：與NCM組（1.505 00±0.510 70）相比，轉(zhuǎn)染mimic后，miRNA-133b-3p的含量明顯上升（11 450±1079，P<0.01），見圖3A；與NCM組（1.015 00±0.079 43）相比，Mimic組P2rx4 mRNA的表達明顯降低（0.492 50±0.049 96，P<0.01），見圖3B；與NCM組（0.814 50±0.042 20）相比，Mimic組PC12細胞中P2rx4蛋白的表達明顯降低（0.367 90±0.017 79，P<0.01），見圖3C；與NCM陰性對照組（0.282 80±0.007 62）相比，Mimic組ΔRatio值明顯降低（0.219 00±0.010 17，P<0.01），見圖3D。

2.3 轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p inhibitor對PC12細胞的影響 轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p inhibitor 48 h后，檢測miRNA-133b-3p的相對含量，P2rx4 mRNA和蛋白的表達變化，以及細胞內(nèi)鈣活動。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48 h后，與NCI組（1.394 00±0.070 86）相比，轉(zhuǎn)染150 nM miRNA-133b-3p inhibitor后，PC12細胞中miRNA-133b-3p的含量降低（0.434 40±0.082 28，P<0.01），見圖4A；與NCI組（1.007 00±0.042 50）相比，Inhibitor組P2rx4 mRNA的表達明顯升高（1.506 00±0.306 80，P<0.01）見圖4B；與NCI組（0.726 60±0.031 06）相比，Inhibitor組P2rx4蛋白的表達增高（0.843 60±0.041 72，P<0.05），見圖4C；與NCI組（0.330 80±0.007 47）相比，Inhibitor組PC12細胞中ΔRatio值升高（0.368 50±0.009 08），（P<0.01），即細胞內(nèi)流的鈣離子濃度增加，見圖4D。endprint

3 討論

課題組之前研究發(fā)現(xiàn)慢性炎性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)miRNA-133b-3p與P2rx4的表達可能存在負相關(guān)關(guān)系。且體外實驗也證實miRNA-133b-3p可與P2rx4 mRNA的3-非編碼區(qū)發(fā)生結(jié)合。因此本研究在PC12細胞內(nèi)干預(yù)miRNA-133b-3p的表達，觀察P2rx4 mRNA和蛋白的表達情況以及PC12細胞鈣活動的改變，以期證實miRNA-133b-3p確實可以調(diào)控P2rx4的表達，并且參與細胞功能改變。

選用大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤PC12細胞株，研究表明，在PC12細胞系可以很好觀察到ATP誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流[8]。此外，該細胞的來源也是大鼠，因此PC12細胞為此次功能驗證實驗提供了一個細胞模型。

P2X嘌呤受體有七個亞型（P2X1～P2X7），是一類可以被細胞外的ATP激活的配體門控離子通道家族[9-10]。它們在疼痛信號的產(chǎn)生和傳遞過程中發(fā)揮的作用[11-12]。筆者檢測了PC12細胞中P2X各種亞型的基礎(chǔ)表達量，結(jié)果顯示，PC12細胞中的P2rx4在鈣內(nèi)流過程中發(fā)揮著顯著的作用。P2rx4的表達水平最高，且激活P2rx4通道后，細胞內(nèi)的鈣內(nèi)流明顯增加。以上結(jié)果表明，PC12細胞是研究P2rx4表達量和功能變化的很好的模型。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過抑制或降解靶基因發(fā)揮調(diào)控作用的[13-14]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，

100 nM miRNA-133b-3p mimic的轉(zhuǎn)染能明顯增加PC12細胞中miRNA-133b-3p的含量，P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表達在細胞中miRNA-133b-3p的含量增加后明顯降低。而150 nM miRNA-133b-3p inhibitor的轉(zhuǎn)染能明顯降低PC12細胞中miRNA-133b-3p的含量，能夠模擬細胞內(nèi)miRNA的低表達。P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表達在細胞中miRNA-133b-3p的表達受到抑制后明顯增加。結(jié)果表明，PC12細胞轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p mimic后，細胞內(nèi)miRNA-133b-3p的含量增加，P2rx4 mRNA水平和蛋白水平的表達均降低；而轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p inhibitor后，細胞內(nèi)miRNA-133b-3p的含量減少，P2rx4 mRNA水平和蛋白水平的表達均升高。所以，這部分結(jié)果充分證實了miRNA-133b-3p確實是可以負向調(diào)控P2rx4的表達的。

在證實miRNA-133b-3p確實可以負向調(diào)控P2rx4的表達之后，筆者對細胞的功能變化進行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-133b-3p模擬物可以減弱PC12細胞內(nèi)ATP誘導(dǎo)的鈣離子的內(nèi)流。而 miRNA-133b-3p抑制劑可以增加PC12細胞內(nèi)ATP誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流。因此，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p mimic降低P2rx4蛋白的表達之后，細胞在受到ATP刺激后，細胞鈣內(nèi)流減少；此外，在轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p inhibitor增加P2rx4蛋白的表達后，ATP誘導(dǎo)的細胞鈣內(nèi)流增加。本實驗對miRNA-133b-3p通過調(diào)控P2rx4蛋白表達影響PC12細胞鈣活動提供了正反兩個方面的證據(jù)。

背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+信號與慢性疼痛的發(fā)展發(fā)展密切相關(guān)[15-17]。外周組織受到強烈的傷害性刺激導(dǎo)致受刺激細胞或神經(jīng)末梢釋放致痛物質(zhì)ATP，ATP可與外周傷害性信息傳入初級感覺神經(jīng)元上的P2受體結(jié)合，使神經(jīng)元細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活ERK-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而激活轉(zhuǎn)錄因子CREB啟動轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)背根神經(jīng)元疼痛相關(guān)基因蛋白的表達，最終增強初級感覺神經(jīng)元的興奮性[18-20]。

綜上，本實驗證實miRNA-133b-3p通過負向調(diào)控P2rx4基因的表達，影響神經(jīng)元鈣活動及其興奮性，最終參與慢性疼痛的形成。

參考文獻

[1] Berger A，Dukes E M，Oster G.Clinical characteristics and economic costs of patients with painful neuropathic disorders[J].Journal of Pain Official Journal of the American Pain Society，2004，5（3）：143-149.

[2] Kandel E，Schwartz J，Jessell T，et al.Principles of Neural Science[M].5th Ed.New York：McGraw-Hill，2013.

[3] Scholz J，Woolf C J.Can we conquer pain[J].Nature Neuroscience，2002，5（Suppl）：1062-1067.

[4] Lagosquintana M，Rauhut R，Lendeckel W，et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J].Science，2001，294（5543）：853-858.

[5] Friedman R C，F(xiàn)arh K H，Burge C B，et al.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs[J].Genome Research，2009，19（1）：92-105.

[6] Tsuda M，Kuboyama K，Inoue T，et al.Behavioral phenotypes of mice lacking purinergic P2X 4 receptors in acute and chronic pain assays[J].Molecular Pain，2009，5（1）：28.endprint

[7] Chen L，Liu Y W，Yue K，et al.Differential expression of ATP-gated P2X receptors in DRG between chronic neuropathic pain and visceralgia rat models[J].Purinergic Signalling，2016，12（1）：79.

[8] Arslan G，F(xiàn)ilipeanu C M，Irenius E，et al.P2Y receptors contribute to ATP-induced increases in intracellular calcium in differentiated but not undifferentiated PC12 cells[J].Neuropharmacology，2000，39（3）：482-496.

[9] Habermacher C，Dunning K，Chataigneau T，et al.Molecular structure and function of P2X receptors[J].Neuropharmacology，2016，104：18-30.

[10] North R A.P2X receptors[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2016，371（1700）：20 150 427.

[11] Burnstock G.Purinergic signalling and disorders of the central nervous system[J].Nat Rev Drug Discov，2008，7（7）：575-590.

[12] Khakh B S，North R A.P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease[J].Nature，2006，442（7102）：527.

[13] Bartel D P.MicroRNA Target Recognition and Regulatory Functions[J].Cell，2009，136（2）：215-233.

[14] Xu T，Zhu Y，Xiong Y，et al.MicroRNA[J].Hepatology，2009，50（1）：113-121.

[15] Sabidodavid C，F(xiàn)aravelli L，Salvati P.The therapeutic potential of Na+ and Ca2+ channel blockers in pain management[J].Expert Opinion on Investigational Drugs，2004，13（10）：1249.

[16] Wang S，Wang S，Asgar J，et al.Ca2+ and Calpain Mediate Capsaicin-induced Ablation of Axonal Terminals Expressing Transient Receptor Potential Vanilloid 1[J].Journal of Biological Chemistry，2017，292（20）：8291.

[17] Xu T L，Duan B.Calcium-permeable acid-sensing ion channel in nociceptive plasticity：a new target for pain control[J].Prog Neurobiol，2009，87（3）：171-180.

[18] Descalzi G，F(xiàn)ukushima H，Suzuki A，et al.Genetic enhancement of neuropathic and inflammatory pain by forebrain upregulation of CREB-mediated transcription[J].Mol Pain，2012，8（1）：90.

[19] Han H J，Lee S W，Kim G T，et al.Enhanced Expression of TREK-1 Is Related with Chronic Constriction Injury of Neuropathic Pain Mouse Model in Dorsal Root Ganglion[J].Biomolecules & Therapeutics，2016，24（3）：252.

[20] Lonze B E，Ginty D D.Function and Regulation of CREB Family Transcription Factors in the Nervous System[J].Neuron，2002，35（4）：605.

（收稿日期：2017-05-17） （本文編輯：程旭然）endprint