伍革民+徐龍鑫+朱麗莉+唐繼高

摘要：為探明促甲狀腺激素釋放激素受體基因TRHR（thyrotropin-releasing hormone receptor，TRHR）與瑤山雞繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，以找出可作為瑤山雞繁殖性狀選育的重要標(biāo)記，采用PCR產(chǎn)物測序法對(duì)促甲狀腺激素釋放激素基因TRH（thyrotropin-releasing hormone，TRH）編碼區(qū)進(jìn)行序列變異檢測，并與繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，在瑤山雞群中，TRHR基因檢測到5個(gè)編碼區(qū)變異位點(diǎn)和1個(gè)內(nèi)含子變異位點(diǎn)，5個(gè)編碼區(qū)變異位點(diǎn)均能引起蛋白質(zhì)相應(yīng)氨基酸發(fā)生同義突變；統(tǒng)計(jì)分析表明，6個(gè)位點(diǎn)與300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡、首次就巢持續(xù)時(shí)間和就巢次數(shù)等性狀均沒有顯著關(guān)聯(lián)性；初步說明，該基因不能作為瑤山雞繁殖性狀選育的候選基因開展輔助選育，但可以作為雞生長性狀的候選基因開展進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：促甲狀腺激素釋放激素受體基因（TRHR）；遺傳變異；荔波縣瑤山雞；繁殖性狀；選育；變異位點(diǎn)；同義突變

中圖分類號(hào)： S831.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0047-03

荔波縣瑤山雞原產(chǎn)于貴州省黔南布依族苗族自治州荔波縣，該雞具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、飼料報(bào)酬高、肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩等特點(diǎn)，是貴州地方雞種中生長發(fā)育較快的雞種之一。荔波縣瑤山雞年產(chǎn)蛋量僅90枚左右，具有較強(qiáng)的就巢性。目前筆者針對(duì)荔波縣瑤山雞已經(jīng)開展了多個(gè)世代的常規(guī)選擇育種，產(chǎn)蛋量從90枚提高到110枚左右，但后期進(jìn)展相當(dāng)緩慢，繼續(xù)常規(guī)選育，產(chǎn)蛋量沒有明顯提高。因此，筆者開展了一些與繁殖性狀相關(guān)的候選基因遺傳檢測，試圖探尋有效的輔助選育標(biāo)記。促甲狀腺激素釋放激素受體基因TRHR（thyrotropin-releasing hormone receptor，TRHR）是筆者選擇的候選基因之一。TRHR受體主要分布于垂體促甲狀腺激素細(xì)胞和促乳素細(xì)胞膜表面，是下丘腦—垂體—性腺軸中的激素之一[1]。促甲狀腺激素釋放激素TRH（thyrotropin-releasing hormone，TRH）發(fā)揮生物功能均須通過與其靶細(xì)胞表面的TRH受體（TRHR）結(jié)合，以激活胞內(nèi)第2信使通路[2-3]。TRHR蛋白序列高度保守，雞的TRHR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能有相當(dāng)大的進(jìn)化約束，其蛋白質(zhì)序列與鼠沒有明顯差異[4]。TRHR基因結(jié)構(gòu)在不同物種中存在差異，如大鼠TRHR全部編碼序列位于同一外顯子上，而小鼠蛋白編碼區(qū)則分布于2個(gè)外顯子上，內(nèi)含子靠近蛋白末端，人的TRHR蛋白編碼區(qū)也由2個(gè)外顯子組成，但內(nèi)含子位于第5與第6跨膜螺旋之間的第3胞內(nèi)環(huán)上[5]。雞的TRHR基因編碼區(qū)包括2個(gè)外顯子，基因序列全長>13 819 bp，mRNA序列全長1 182 bp，2個(gè)外顯子中間分布有12 637 bp的內(nèi)含子序列。文獻(xiàn)搜索沒有發(fā)現(xiàn)雞的TRHR基因序列變異或差異表達(dá)與繁殖、生長等表型性狀的相關(guān)報(bào)道，對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行雞的TRHR基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）搜索，沒有檢索到雞中該基因的SNP登記，本研究針對(duì)該基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用PCR產(chǎn)物回收后直接測序法，檢測瑤山雞群體該基因編碼區(qū)的序列變異情況，并與部分繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以探討其作為繁殖性狀輔助選育基因的可行性。

1材料與方法

1.1荔波縣瑤山雞

試驗(yàn)雞為120日齡荔波縣瑤山雞母雞，60羽，選自貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村種雞場，均采用常規(guī)飼養(yǎng)管理，個(gè)體籠養(yǎng)，群體一致性較好，性能較為穩(wěn)定。翅下靜脈采血1.0～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20 ℃保存。

1.2性狀測定

120日齡母雞轉(zhuǎn)入產(chǎn)蛋舍單只籠養(yǎng)至300日齡，測定或觀測開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體質(zhì)量、就巢性等繁殖性狀，測定方法按照NY/T 823—2004《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計(jì)方法》[6]進(jìn)行。

1.3基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì)

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣DNA。根據(jù)GenBank中雞的TRHR基因編碼區(qū)序列合成2對(duì)引物（天根生化科技有限公司），引物信息見表1。

1.4PCR擴(kuò)增及測序

PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix試劑10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性6 min，95 ℃變性30 s，特定溫度（表1）退火30 s，72 ℃延伸45 s），35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后委托諾賽基因組研究中心有表1引物信息

引物序列

（5′→3′）擴(kuò)增長度

（bp）位置位點(diǎn)退火溫度

（℃）P1F：GCGACGAGCAGAACCATACT；R：GCAAACTGCTGTTCCTACCT797第1外顯子、部分內(nèi)含子17～81358P2F：TCCTTTTCAGCCCAGGTCATT；R：TTGGCAGGTTTCTTGTCCCG632部分內(nèi)含子、第2外顯子13 051～13 68260

限公司對(duì)60個(gè)樣本進(jìn)行測序檢測。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

使用DNAstar軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行校正，進(jìn)入基因庫網(wǎng)站采用Blast分析序列SNPs，采用DNAMAN軟件分析SNPs變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼變異的情況。以Excel軟件統(tǒng)計(jì)60羽雞TRHR基因分型，利用PopGen32軟件分析群體多樣性，利用SPSS 18.0軟件采用單因子方差分析方法分析基因型與繁殖性狀的相關(guān)性。

2結(jié)果與分析

2.1序列變異檢測和群體遺傳多樣性

60羽瑤山雞中共檢測到6個(gè)變異位點(diǎn)；5個(gè)位點(diǎn)位于第1外顯子區(qū)，基因位置分別為249、252、291、411、705位置，變異分別引起蛋白質(zhì)第83、84、98、137、235氨基酸位置發(fā)生同義突變；1個(gè)位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)；第2外顯子區(qū)沒有檢測到核苷酸變異（表2）。對(duì)各位點(diǎn)在瑤山雞群體的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，各位點(diǎn)平均雜合度在0.39～0.50之間，多態(tài)信息含量在0.31～0.37之間，遺傳多樣性處于中等水平。哈迪溫伯格平衡的卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，各位點(diǎn)均沒有偏離平衡狀態(tài)（P>0.05，表3）。

2.2變異位點(diǎn)基因型與繁殖性狀的相關(guān)性

變異位點(diǎn)基因型與個(gè)體繁殖性狀的單因素方差分析F檢驗(yàn)結(jié)果見表4，均值描述及基因型間多重比較結(jié)果見表5。從表4、表5可知，本次檢測到的TRHR基因編碼區(qū)的5個(gè)變異位點(diǎn)和內(nèi)含子區(qū)的1個(gè)變異位點(diǎn)基因型間開產(chǎn)日齡、300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡、首次就巢持續(xù)時(shí)間、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔以及300日齡就巢次數(shù)等繁殖性狀差異不顯著，位點(diǎn)變異與上述繁殖性狀無顯著性關(guān)聯(lián)。

3結(jié)論與討論

候選基因鑒定法是分析數(shù)量性狀基因的重要方法之一。TRHR主要分布于垂體促甲狀腺激素細(xì)胞和促乳素細(xì)胞中，是下丘腦-垂體-性腺軸中的激素之一[1]。免疫組織化學(xué)方法研究表明，TRHR激素在獼猴子宮中表達(dá)，對(duì)子宮功能有直接作用[7]。定量PCR表明，豬TRHR基因在腦、垂體和睪丸中表達(dá)[8]。筆者推測，TRHR可能與性腺功能有關(guān)，因此，筆者把TRHR基因作為雞繁殖性狀關(guān)聯(lián)的候選基因之一，開展序列變異檢測并與繁殖性狀關(guān)聯(lián)研究。結(jié)果表明，在瑤山雞群體檢測的該基因5個(gè)編碼區(qū)變異點(diǎn)和1個(gè)內(nèi)含子變異點(diǎn)與300日齡產(chǎn)蛋量、就巢性狀等沒有顯著關(guān)聯(lián)性，說明該基因不能用于瑤山雞繁殖性狀輔助選育的候選基因。在雞中，該基因序列變異或差異表達(dá)與表型性狀的關(guān)聯(lián)研究沒有檢索到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但在其他動(dòng)物中有相關(guān)研究報(bào)道，這些報(bào)道主要集中于對(duì)生長性狀的研究。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，人類TRHR基因突變造成中樞性甲狀腺功能減退綜合征，患者表現(xiàn)出生長發(fā)育遲緩、矮胖和行動(dòng)遲鈍等癥狀[9]。TRHR基因在一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)分析中被指出與人類瘦體質(zhì)量個(gè)體變異有顯著關(guān)聯(lián)[10]。研究表明，TRHR基因多態(tài)性對(duì)豬個(gè)體頭質(zhì)量和胴體長有顯著效益，與系水力、肌內(nèi)水分和肌內(nèi)脂肪等肉質(zhì)指標(biāo)有顯著關(guān)聯(lián)[3]。高密度SNP芯片檢測結(jié)果表明，1個(gè)拷貝數(shù)變異多態(tài)區(qū)域上游的TRHR基因可能通過骨骼肌的發(fā)育調(diào)控作用，影響羔羊生長發(fā)育性狀[11]。上述試驗(yàn)表明，該基因有可能是生長發(fā)育性狀的一個(gè)候選基因，本試驗(yàn)初步否定了該基因作為繁殖性狀選育的候選基因，但不排除該基因作為雞生長性狀的候選基因開展進(jìn)一步試驗(yàn)，本研究為該基因在雞中的研究提供了理論思路。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.013