高海慧 康曉冬

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，寧夏銀川750002）

寧夏地區(qū)奶牛副結(jié)核病的血清學(xué)調(diào)查

高海慧 康曉冬*

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，寧夏銀川750002）

為了解寧夏地區(qū)奶牛副結(jié)核病的發(fā)病與流行情況，我們于2017年5月～7月對寧夏奶牛養(yǎng)殖區(qū)的9個(gè)奶牛養(yǎng)殖場按照5%的比例隨機(jī)采血1796份，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測奶牛副結(jié)核病血清抗體。結(jié)果顯示，存在副結(jié)核血清陽性牛，各場奶牛陽性率在1.78%～15.15%不等，樣品血清平均陽性率為4.29%；表明該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖場中存在，感染處在中等水平。

寧夏 奶牛 牛副結(jié)核 流行病學(xué)調(diào)查

牛副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌引起的以牛慢性增生性、頑固性腸炎和進(jìn)行性消瘦為特征的人畜共患傳染病[1]，根據(jù)菌株培養(yǎng)特性及致病力可將該菌分為3個(gè)亞型，即Ⅰ型（羊型）、Ⅱ（牛型）及Ⅲ型（生物中間型），不同亞型培養(yǎng)方法不盡相同[2]，該病主要由消化道感染，處于排菌期的牛，通過糞便、乳汁排菌，其他易感牛只通過經(jīng)口途徑感染該菌[3]。副結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，對環(huán)境抵抗力強(qiáng)，能長時(shí)間在飼料、水源、土壤等被污染環(huán)境中存在，呈世界性分布，我國最早在內(nèi)蒙古發(fā)現(xiàn)牛副結(jié)核病。該病可造成奶牛體重下降、生產(chǎn)性能下降、產(chǎn)乳量降低、多種疾病的產(chǎn)生，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展，更嚴(yán)重地威脅著公共衛(wèi)生安全，需要引起足夠重視。為了更全面掌握該病在寧夏奶牛養(yǎng)殖中的流行和分布情況，本研究使用美國愛得士生物科技公司（IDEXX）生產(chǎn)的副結(jié)核分枝桿菌抗體ELISA試劑盒對寧夏回族自治區(qū)2017年5月～7月以5%比例隨機(jī)采集的1796頭奶牛血清進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 被檢血清 遴選寧夏石嘴山市、銀川市、吳忠具有代表性的9個(gè)奶牛養(yǎng)殖場，按照5%的比例隨機(jī)無菌采取血樣1796份，室溫下靜置2～3h，4℃下3000 r/min 離心5min，析出血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?，檢測前放置于室溫條件下自然解凍。

1.1.2 檢測試劑 副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒：美國愛得士生物科技公司（IDEXX）生產(chǎn)。

1.1.3 主要檢測儀器設(shè)備 H-1850 R 臺式高速冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)有限公司），iMark 酶標(biāo)儀（美國 BIO-RAD 公司），RT-3000 全自動洗板機(jī)（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司），微量移液器（德國 Eppendorf 公司）。

1.2 檢測方法

1.2.1 奶牛副結(jié)核病抗體檢測 在抗原包被微量反應(yīng)板加入100μl已稀釋孵育的樣品和對照，震蕩混勻，18-26℃孵育45min或者2-8 ℃過夜孵育（16-24h），棄去液體，300μl洗滌溶液（20倍稀釋）洗滌3次后拍干，每孔加入100μl稀釋好的酶標(biāo)抗體，蓋板后18-26℃孵育30min，300μl洗滌溶液（20倍稀釋）

洗滌3次后拍干，每孔加入100μlTMB底物，18-26℃遮光孵育10min，每孔加入100μl終止液，450 nm下測量樣品盒對照的光密度值。具體操作見副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒操作說明。

1.2.2 結(jié)果判定 陽性對照平均值大于或等于0.350，陽性對照平均值與陰性對照平均值的比值大于或等于3.00的條件下檢測的結(jié)果有效，否則試驗(yàn)不成立，應(yīng)重新檢測。

按照以下S/P百分值計(jì)算判定每個(gè)樣品的結(jié)果：S/P（%）=100*（O D樣本-O D陰性）/（O D陽性-O D陰性）；當(dāng)樣品的S/P%小于或等于45%，判為抗體陽性，樣品的S/P%大于45%且小于55%，判為抗體可疑，樣品的S/P%大于或等于55%，判為抗體陽性。

2 結(jié)果與分析

在9個(gè)奶牛場的1796份血清樣品中，檢出副結(jié)核病抗體陽性血樣77份，平均血清陽性率為4.29%，在9個(gè)被檢牛場中有7個(gè)奶牛場檢出血清陽性牛，陽性率從1.78%～15.15%不等，場感染陽性率為77.78%，具體詳見表1。

表1 寧夏地區(qū)奶牛副結(jié)核病血清抗體檢測結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 檢測方法

牛副結(jié)核病是一種高傳染性和高損傷性的疫病，給我國畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失，肉牛和奶牛還需要引起獸醫(yī)公共衛(wèi)生重視，所以加強(qiáng)該病的監(jiān)測和防治具有重要意義。ELISA方法具有敏感、準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)、主觀因素影響小等優(yōu)點(diǎn)已成為國內(nèi)外動物疫病常規(guī)的檢疫方法，是當(dāng)前牛副結(jié)核檢測最常用的方法之一，是大量樣本檢測的優(yōu)選方法，為確保ELISA實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，采樣要盡量減少血清樣本運(yùn)輸貯藏過程中出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

3.2 寧夏地區(qū)奶牛副結(jié)核血清學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果

近年來，我國畜牧業(yè)發(fā)展迅速，隨著養(yǎng)牛規(guī)模的不斷擴(kuò)大，奶牛副結(jié)核病的傳播之勢也迅猛增加，這會對我區(qū)畜牧業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成一定的威脅。本試驗(yàn)所采集樣品來自寧夏不同地區(qū)規(guī)模化奶牛場，具有一定代表性。檢測結(jié)果顯示，被檢9個(gè)奶牛場中7個(gè)奶牛場存在抗體陽性牛，總體陽性率為4.29%，介于研究報(bào)道的我國內(nèi)蒙古，黑龍江、湖北、四川、安徽、江蘇6個(gè)省市1.22%-8%的陽性率[4]，證明該病在寧夏地區(qū)的感染處于中間水平，但是隨著養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展和牛只的頻繁交易，該病會繼續(xù)傳播蔓延，需高度重視。

3.3 寧夏地區(qū)奶牛副結(jié)核病的防控

第一，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，營造良好的衛(wèi)生環(huán)境，制定科學(xué)的免疫接種方案，定期開展奶牛副結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查；第二，加強(qiáng)畜群奶牛副結(jié)核病凈化工作，及時(shí)檢出、隔離、淘汰感染牛，凍精必須經(jīng)過嚴(yán)格的檢查，確保沒有奶牛副結(jié)核病污染的才能投入使用；第三，加強(qiáng)檢疫，加強(qiáng)牛只引進(jìn)檢疫，鼓勵(lì)自繁自養(yǎng)，防止引入病原。

[1]田克恭.人與動物共患病[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[2] Castellanos E，de Juan L，Domnguez L，et al.Progress inmolecular typing of subspecies paratuber-culosis [J].Res Vet Sci，2012，92 （2）：169-179.[C]Arsenault RJ，Li Y，Bell K，Doig K，Potter A，Griebel PJ，Kusalik A，Napper S.Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis inhibits gamma interferon-induced signaling in bovinemonocytes：insights into the cellularmechanisms of Johne's disease[J].Infection and immunity，2012，80（9）：3039-3048.

[3]Manning E，Collins M.Mycobacterium avium subsp .paratuberculosis：pathogen，pathogenesis and diagnosis[J].Revue scientifique et technique（International Office of Epizootics），2001，20（1）：133-150.

[4]崔金磊.我國6省市牛副結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

寧夏地區(qū)奶牛副結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查及快速診斷技術(shù)研究，項(xiàng)目編號：NKYJ-17-09

高?；郏?990-），女，寧夏鹽池人，助理研究員，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究工作。

康曉冬