李 欣，李 楨，李娜娜，張旭華，張 靖，陳柳妃，寧官保，張 鼎，田文霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

重組雞GSTA3蛋白對(duì)福美雙誘導(dǎo)肉雞TD的血清GST-α含量的影響

李 欣，李 楨，李娜娜，張旭華，張 靖，陳柳妃，寧官保，張 鼎，田文霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

為研究重組雞GSTA3蛋白對(duì)肉雞TD抗氧化功能的影響，先構(gòu)建肉雞TD模型，即通過(guò)肌肉注射不同劑量（20，50 μg/kg）的原核表達(dá)雞GSTA3蛋白，運(yùn)用ELISA技術(shù)檢測(cè)血清中GST-α的含量。結(jié)果表明，與空白組相比，飼喂福美雙第1，2，4天，血清GST-α的含量顯著上升（P＜0.05），注射蛋白組與飼喂福美雙組相比，試驗(yàn)第1天，GST-α的含量沒(méi)有顯著差異，試驗(yàn)第2，4天，GST-α的含量顯著降低（P＜0.05），而高劑量組與低劑量組之間GST-α的含量無(wú)顯著性差異。GSTA3可通過(guò)修復(fù)肝臟損傷增強(qiáng)其抗氧化能力，直接或間接調(diào)節(jié)軟骨組織中軟骨細(xì)胞在TD發(fā)生過(guò)程中的功能。

肉雞；脛骨軟骨發(fā)育不良；重組雞谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶；抗氧化功能

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GSTs）是生物體內(nèi)一類(lèi)復(fù)雜的同工酶類(lèi)，它廣泛存在于各種哺乳動(dòng)物、植物、鳥(niǎo)類(lèi)、昆蟲(chóng)、寄生蟲(chóng)以及微生物中，是生物體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分之一。GSTs主要的功能是可以將共軛狀態(tài)中的還原型谷胱甘肽（GSH）轉(zhuǎn)化為親電子中心的物質(zhì)，使其更易于透過(guò)細(xì)胞膜從而排出細(xì)胞外，最終起到解毒的作用；同時(shí)，GSTs還是一種不含硒的過(guò)氧化物酶，可以催化部分過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)而防止脂質(zhì)的過(guò)氧化損傷作用[1]。有研究顯示，GSTs的大量表達(dá)與機(jī)體自身的抗性有關(guān)，在魚(yú)類(lèi)中，GSTs基因表達(dá)越多，對(duì)生存的水環(huán)境中微囊藻毒素的抵抗力就越強(qiáng)[2]。肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（Tibial dyschon dropla sia，TD）是一種骨骼性疾病，干擾脛骨生長(zhǎng)板軟骨的正常骨化功能，在這個(gè)過(guò)程中同時(shí)伴隨著許多對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)產(chǎn)生。福美雙的代謝主要在肝臟中進(jìn)行，而機(jī)體許多與骨生成、重建的相關(guān)酶類(lèi)的合成也是在肝臟中完成[3]，但是，肝臟在代謝福美雙的過(guò)程中，肝臟本身會(huì)受到影響，導(dǎo)致機(jī)體解毒能力和抗氧化能力降低[4]。劉紅霞[5]研究發(fā)現(xiàn)，GSTA3與CYP450共同參與機(jī)體解毒，可以清除易于誘發(fā)TD的毒性物質(zhì)。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院生物制品實(shí)驗(yàn)室前期成功克隆表達(dá)雞GSTA3并獲得其活性蛋白，本試驗(yàn)通過(guò)肌肉注射GSTA3蛋白到肉雞體內(nèi)，探討重組雞GSTA3蛋白對(duì)TD肉雞血清中GST-α含量的影響，旨在為后期TD預(yù)防治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試肉雞為1日齡AA肉雞，共90羽，購(gòu)自山西省文水縣大象農(nóng)牧集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

雞谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶α（GST-α）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所；重組雞GSTA3活性蛋白由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制品實(shí)驗(yàn)室前期成功表達(dá)。

1.3 試驗(yàn)方法

根據(jù)田文霞等[6]方法復(fù)制肉雞TD模型，90羽1日齡AA肉雞預(yù)飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為6組，每組15羽，A，B，C組為基礎(chǔ)日糧對(duì)照組，D，E，F(xiàn) 組為飼喂福美雙組。具體分組及方法如表1所示。試驗(yàn)期間，肉雞自由采食、飲水。分別在攻毒后第1，2，4天每組隨機(jī)選取5只雞，翅靜脈采抗凝血，離心，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 動(dòng)物分組及方法

1.4 血清GST-α測(cè)定

根據(jù)雞谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶α（GST-α）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相應(yīng)的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程，測(cè)得樣品的OD值代入回歸方程，即可計(jì)算出各樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)ELISAcalc軟件，得到回歸方程如下。

繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，空白組及福美雙攻毒組肉雞血清GST-α含量如表2所示。

從表2可以看出，在肉雞日糧中添加福美雙，可以導(dǎo)致肉雞血清中GST-α含量顯著升高（P＜0.05）；試驗(yàn)第1天，肌肉注射原核表達(dá)雞GSTA3蛋白后，血清中GST-α含量與飼喂福美雙組相比沒(méi)有顯著差異；而在試驗(yàn)第2，4天，肌肉注射原核表達(dá)雞GSTA3蛋白，無(wú)論是低劑量（20 μg/kg）還是高劑量（50 μg/kg）與飼喂福美雙組相比，肉雞血清中GST-α的含量顯著降低（P＜0.05），與空白組相比沒(méi)有顯著性差異。

表2 重組雞GSTA3蛋白對(duì)正常和TD肉雞血清GST-α含量的影響 ng/mg

3 討論

脛骨軟骨發(fā)育不良（TD）主要在生長(zhǎng)速度快的肉禽動(dòng)物上常見(jiàn)，主要病變?cè)谕炔?，是一種軟骨代謝障礙性的疾病[7]。該病于1965年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，無(wú)地域性，可在全世界范圍內(nèi)發(fā)生，對(duì)禽類(lèi)養(yǎng)殖所造成的損失較大。其主要表現(xiàn)有精神萎靡，食欲不振，早期跛行，中后期不能站立，雙翅常撐于地面，脛骨關(guān)節(jié)腫大。關(guān)節(jié)剖面可見(jiàn)生長(zhǎng)板變厚，形成玉白色軟骨栓，與鈣化區(qū)顏色分明，且該區(qū)域缺乏血管。患有TD的肉雞極易引發(fā)其他疾病，免疫力和生產(chǎn)性能均受到嚴(yán)重影響，肉質(zhì)等級(jí)下降[8-9]。目前可知的引發(fā)TD原因主要是人為的選育生長(zhǎng)迅速的品種，飼養(yǎng)環(huán)境不適宜以及飼料成分比例不當(dāng)，其具體的致病機(jī)理尚不清楚[10-12]。為了弄清引發(fā)TD的原因，并設(shè)法預(yù)防或治療TD，越來(lái)越多的學(xué)者加入到TD的研究大軍中。RATH[13]等研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在飼料中添加一定濃度的福美雙可以顯著提高肉雞TD的發(fā)病率，這種由福美雙誘導(dǎo)的TD與自然狀態(tài)下發(fā)病的TD癥狀極為相近[14]。福美雙作為一種親脂化合物，可以與細(xì)胞膜結(jié)合，造成細(xì)胞膜損傷，同時(shí)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，直接或間接影響骨的重建過(guò)程，而細(xì)胞凋亡與谷胱甘肽代謝的異常也有著顯著的關(guān)系。

GST是機(jī)體中最為重要的抗氧化酶，在體內(nèi)可以清除過(guò)氧化物，而GST-α是肝臟中表達(dá)并分泌最多的一種谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶[15]，這種酶類(lèi)具有非硒依賴性的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，可催化過(guò)氧化脂肪酸的還原，并且抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷的過(guò)程[16]；另外，氧化應(yīng)激可以影響GST基因表達(dá)，還可以通過(guò)氧自由基（ROS）誘導(dǎo)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性（GSH合成的限速酶），進(jìn)而增加GSH的合成量[17]，而細(xì)胞內(nèi)GSH的含量可以抑制GST基因的表達(dá)[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，福美雙誘導(dǎo)肉雞TD發(fā)生過(guò)程中，肉雞肝的抗氧化能力降低[3]，肝臟中GSH含量減少[20]。在本試驗(yàn)中，飼喂福美雙組肉雞血清GST-α的含量上升，由于福美雙在肝臟中的代謝，導(dǎo)致肝抗氧化能力減弱，GSH含量的降低對(duì)GST表達(dá)抑制的功能減弱，因此，GST-α合成分泌增加；在試驗(yàn)第1天，與飼喂福美雙組相比，重組雞GSTA3蛋白對(duì)TD肉雞血清中GST-α含量的影響沒(méi)有顯著差異。在試驗(yàn)第2，4天，注射重組雞GSTA3蛋白后，血清中GST-α含量降低。進(jìn)一步說(shuō)明，重組GSTA3蛋白可以通過(guò)一定的方法降低血清中GST-α含量，進(jìn)而間接提高肝臟的抗氧化能力，降低肉雞TD的損傷程度，試驗(yàn)中使用的2個(gè)劑量之間沒(méi)有差異。

4 結(jié)論

肌肉注射一定劑量的原核表達(dá)雞GSTA3蛋白，可以顯著降低血清GST-α水平，修復(fù)肝損傷，增強(qiáng)肝抗氧化能力，直接或間接地調(diào)節(jié)軟骨相關(guān)細(xì)胞的功能，GSTA3在TD發(fā)生過(guò)程中有著重要的作用。

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Effect of Recombinant Broiler Protein GSTA3 on the Expression of GST-α in Serum of TD Induced by Thiram

LI Xin，LI Zhen，LI Nana，ZHANGXuhua，ZHANGJing，CHENLiufei，NINGGuanbao，ZHANGDing，TIANWenxia
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To study the effect ofthe recombinant chicken GSTA3 protein on the anti-oxidative function of TD of broiler,the broiler TDmodel was constructed firstly,and the chicken GSTA3 protein was expressed byintramuscular injection ofdifferent doses（20,50 g/kg）,and the content of GST-α in serum was detected by ELISA.The results showed that compared with the control group,the content of GST-α significantly increased in the first and second days（P＜0.05）.Compared with the feeding and injecting groups,there was no significant difference ofGST-α on the first day,but the content ofGST-α significantlydecreased at 2,4 days（P＜0.05）,and there was no significant difference between high dose group and low dose group.We suggest that GSTA3 can enhance the antioxidant capacity of the liver byrepairingthe liver injury,directlyor indirectlyregulate the cartilage cells in the cartilage cells in the process ofTD.

broiler;TD;recombinant chicken GSTA3;antioxidant function

S831.1

A

1002-2481（2017）11-1853-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.11.29

2017-06-05

晉中市重點(diǎn)科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目（P171002-3）；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2017-073）；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311027-3）；2017年地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201710113001）；2017年山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2017081）

李 欣（1990-），女，山西太谷人，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物傳染病發(fā)病與免疫機(jī)理。田文霞為通信作者。