楊 珍，郭林滾,單文杰，許 翔，熊亞坤，汪 娟，方 柳，羅慶華，鄒雨妃，于士蒙，黃幸幸，劉克東，付戴波

（1.九江市畜牧獸醫(yī)局 九江 332000；2.廬山市農業(yè)局；3.共青城市農林水務局；4.重慶市畜牧科學院）

應用16SrRNA技術快速檢測一例雛雞銅綠假單胞菌感染

楊 珍1，郭林滾2,單文杰3，許 翔1，熊亞坤1，汪 娟1，方 柳1，羅慶華4，鄒雨妃1，于士蒙1，黃幸幸1，劉克東1，付戴波1

（1.九江市畜牧獸醫(yī)局 九江 332000；2.廬山市農業(yè)局；3.共青城市農林水務局；4.重慶市畜牧科學院）

為快速診斷一例雛雞死亡病因，本研究從病死雛雞內臟分離獲得一分離菌，運用分子生物學技術，快速擴增病原菌的16SrRNA基因，經(jīng)測序獲得一條長1439bp的16SrDNA序列，與GeneBank已知序列進行BLAST檢索，結果表明該分離菌歸類于假單胞菌屬，應用生物信息學軟件對目的基因進行分析，顯示與銅綠假單胞菌高度相似，同源性高達99.9%，結合發(fā)病情況，初步判定為養(yǎng)殖場外環(huán)境消毒不嚴格，造成雛雞銅綠假單胞菌感染。

雛雞；銅綠假單胞菌；16SrRNA基因；分子進化樹

0 引言

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，位于變形菌綱——γ亞綱，假單胞菌科下的假單胞菌屬，為革蘭陰性菌，廣泛分布于自然界，在水、空氣、土壤等多處存在。銅綠假單胞菌多為條件致病菌，可引起雞、鴨、鵪鶉、水貂、長臂猿、奶牛、大熊貓、袋鼠、蟒蛇等多種動物感染性疾病，多引起動物的呼吸道炎癥、化膿性炎癥、腹膜炎、關節(jié)炎、腸炎、子宮炎及肉芽腫等疾病[1-3]。

本研究針對重慶某雞場育雛雞發(fā)生大量死亡病例，對雛雞的病料組織進行病原菌分離，應用16S rRNA技術進行快速鑒定，為臨床快速防治該病提供參考。

1 發(fā)病情況

重慶某雞場育雛雞，接種馬立克氏疫苗后3d，出現(xiàn)精神沉郁，食欲檢測，隨后相繼批量死亡現(xiàn)象，發(fā)病率達到60%，死亡率約32%，懷疑馬立克氏疫苗所致。

2 材料與方法

2.1 主要試劑

普通鮮血培養(yǎng)基由西南大學提供，基因組抽提試劑盒、PCR擴增試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司，PCR反應引物[4]由上海百力格生物技術有限公司合成（引物序列為F:5’-AGAGTTT?GATCCTGGCTCAG-3’，R:5’-GGTTACCTTGT?TACGACTT-3’）；DNA Marker、核酸染色劑、DNA純化試劑盒等購于上海生工生物工程有限公司。

2.2 病原菌分離

剖解病死雛雞，用接種針挑取心臟、肝臟、肺臟等組織表面黏液，接種于普通鮮血培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h，連續(xù)純化后置于4℃冰箱保存，備用。

2.3 模板DNA提取

事先取50ul Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（裂解液）置于滅菌的Micotube中。挑取4℃冰箱保存的分離菌于普通培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，18～24h后，用滅菌牙簽或滅菌的槍頭挑取單個菌落于Micotube中，攪拌混勻。80℃熱變性15～20min，低速離心10min,取1～5μL上清液做擴增反應模板。

2.4 目的基因擴增

以基因組DNA為模板，用細菌16SrDNA的通用引物對PF/PR（序列對見2.1主要試劑），進行PCR擴增，目的片段預期大小約為1500bp，反應體系見表1、表2。

表1 反應擴增體系

表2 反應擴增程序

2.5 目的基因檢測

取5μL PCR產(chǎn)物混合1μL 6×Loading Buffer進行1%瓊脂糖凝膠電泳。加入DL2000 Marker作對照，在1～10V／cm凝膠電壓下進行電泳35min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝像記錄結果。

將凝膠成像系統(tǒng)下，熒光效果良好PCR產(chǎn)物，進行10×Loading Buffer于1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收DNA（按照上海生工生物工程有限公司Gel Ex?traction Kit D2500-01膠回收試劑盒的指導說明進行），送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2.6 生物信息學比對分析

運用NCBI網(wǎng)站的Blastn程序，將所測得的基因序列與GeneBank中已經(jīng)注冊的基因序列進行多序列同源性比對分析，結合生物信息學軟件（DNAstar），運用鄰接法（neighbor joining method）構建生物進化樹。

3 試驗結果

3.1 目的基因的電泳結果

利用細菌通用引物擴增細菌16SrRNA基因，瓊脂糖凝膠電泳結果（見圖1）顯示該基因片段大小約1500bp，符合預期大小。

圖1 16S rRNA基因電泳結果

3.2 目的基因測序結果

選擇紫外熒光下亮度較強的產(chǎn)物進行膠回收純化，將純化的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，得到一條長為1439bp的序列。

3.2 目的基因生物信息學分析

將目的片段序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，在線BLAST檢索后，相似度最高的物種為銅綠假單胞菌，下載這些序列，鑒于相關報道提出惡臭假單胞菌與銅綠假單胞菌相似程度非常高，同時在GeneBank中選擇2株親緣關系接近的惡臭假單胞菌用作參照，利用軟件生物信息學程序（DNA?STAR）進行同源性分析，結果顯示分離株CQ-1與已知銅綠假單胞菌序列同源性最高達99.9%，與已知惡臭假單胞菌的同源性最高僅為94.5%。構建進化樹可見分離株CQ-1與銅綠假單胞菌的進化距離更為接近（見圖2、圖3）。

圖2 CQ-1 16SrRNA基因的同源性比較結果

圖3 CQ-1 16SrRNA基因核苷酸序列構建進化樹

4 分析及討論

雞養(yǎng)殖行業(yè)在國民經(jīng)濟中有著重要的地位，是我國畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，也是規(guī)?；s化程度最高，與國際先進水平最接近的產(chǎn)業(yè)。與此同時，雞養(yǎng)殖行業(yè)也面臨著來自病原微生物的巨大挑戰(zhàn)，其中育雛期是養(yǎng)雞生產(chǎn)中的基礎階段，育雛階段的好壞直接影響禽群整個生長期的正常發(fā)育。育雛階段禽免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，抗病能力低，在飼養(yǎng)管理條件不當?shù)那闆r下極易受到病原微生物的入侵，引起大批死亡[5]。筆者建議養(yǎng)殖場要特別注意加強對育雛階段雛雞管理工作。

臨床上引起人和動物發(fā)病的假單胞菌屬主要為銅綠假單胞菌，而且目前相關報道也比較普遍，對動物養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大經(jīng)濟損失。2012年齊靜[6]等人從病死毛皮動物貂上分離出39株銅綠假單胞菌，2016年，孫鑫鵬[7]等人報道了一起銅綠假單胞菌造成50只獺兔死亡的病例。同樣，銅綠假單胞菌對家禽業(yè)的影響也比較大，2007年張媛[8]等就從黃綠色雞肉中分離到銅綠假單胞菌，2010～2011年部分地區(qū)也相繼報到出銅綠假單胞菌引起育雛雞死亡的病例[9-10]，與本研究情況較為相似，特別房海[9]等人的報道與本研究極為相似，均是在注射馬立克氏病疫苗后出現(xiàn)死亡。

16SrRNA基因鑒定技術是從分子遺傳進化及分子水平層面對病原菌進行鑒定，一方面使的獸醫(yī)臨床病原菌鑒定更加快捷，另一方面也使的病原菌的鑒定更為科學、準確[11]。由于16SrRNA基因進化非常緩慢，具有高度保守的特征，因此常用于標記生物間的進化距離及親緣性，通常認為16SrRNA基因在98.8%以上就可算作同一個種[12]，本研究中分離菌與已知序列的相似性高達，因此可判斷該分離菌為銅綠假單胞菌。

5 結論及建議

本研究從重慶某雞場病死雛雞分離到一株病原菌CQ-1，根據(jù)16SrRNA基因同源性分析可判定為銅綠假單胞菌。綜合銅綠假單胞菌生物學特性及實際情況，判斷感染與禽場環(huán)境及飼養(yǎng)器皿消毒不徹底有關，由于接種器械及接種部位的消毒不嚴格，為該致病菌傳播創(chuàng)造了條件，建議該養(yǎng)雞場做好飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生管理及接種器械嚴格消毒工作。

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[6]齊靜,李云,劉遠見等.山東榮成地區(qū)貂源銅綠假單胞菌的分離鑒定及抗藥性分析[J].中國獸醫(yī)雜志,2012,(09)：35-37.

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S851.34+7.2

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2017-09-12.