繆曉翔,肖 潔,張學(xué)雷*,劉瑞娟,AUNGTONYA Charatsee

(1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061;2.海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與工程國(guó)家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266061;3.Phuket Marine Biological Center,Phuket 83000,Thailand)

基于線粒體COI基因的泰國(guó)近海有毒水母遺傳多樣性研究

繆曉翔1,2,肖 潔1,2,張學(xué)雷1,2*,劉瑞娟1,2,AUNGTONYA Charatsee3

(1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061;2.海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與工程國(guó)家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266061;3.Phuket Marine Biological Center,Phuket 83000,Thailand)

利用編碼線粒體細(xì)胞色素氧化酶I(COI)的基因片段序列,對(duì)泰國(guó)近海有毒水母69個(gè)樣本進(jìn)行遺傳多樣性研究,并探討該片段作為DNA條形碼對(duì)泰國(guó)近海有毒水母類進(jìn)行快速分類鑒定的可行性,以期為后續(xù)有毒水母的監(jiān)測(cè)和預(yù)警、生物學(xué)和生態(tài)學(xué)等的研究提供技術(shù)支撐?；驂A基組成分析表明,立方水母COI序列GC含量為42.1%,明顯高于缽水母(37.1%)和水螅水母(36.9%)。COI基因編碼氨基酸的密碼子第3位點(diǎn)GC含量(30.2%)顯著低于第1,2位點(diǎn)(分別為47.4%,42.1%),且該位點(diǎn)堿基替換頻率最高,轉(zhuǎn)換/顛換比值為1.0,表明該位點(diǎn)堿基突變趨于飽和;但去除密碼子第3位點(diǎn),對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建無顯著影響。根據(jù)COI序列計(jì)算3個(gè)綱水母的K2P(Kimura 2-parameter)遺傳距離,得出種內(nèi)遺傳差異為0.000～0.151,均值為0.036,同綱種間遺傳差異為0.167～0.321,均值為0.263,綱間遺傳差異為0.246～0.385,均值為0.334。該COI基因片段能夠快速有效區(qū)分這些有毒水母種類。研究表明,泰國(guó)沿岸水母多樣性較高,所獲69個(gè)樣品可以分為13個(gè)種,包括5種缽水母、6種立方水母和2種水螅水母,其中Carukiidae科存在新屬新種。立方水母的地理分布具有明顯的區(qū)域特征,馬來半島東西兩岸存在物種和遺傳多樣性差異,其產(chǎn)生原因還有待于進(jìn)一步研究。

立方水母;缽水母;DNA條形碼;COI序列;泰國(guó)

刺胞動(dòng)物門(Cnidaria)中的水母亞門(Medusozoa)包含水螅蟲綱(Hydrozoa)、缽水母綱(Scyphozoa)、立方水母綱(Cubozoa)和十字水母綱(Staurozoa)四個(gè)綱。其中,立方水母雖然是種類數(shù)量最少的一個(gè)綱(目前已知僅有約36種[1]),但許多種類毒性極強(qiáng),例如:Chironex fleckeri被稱為“海黃蜂(Sea wasp)”,人被大面積螫傷后可導(dǎo)致幾分鐘內(nèi)死亡[2]。這些劇毒立方水母的廣泛分布,嚴(yán)重影響著沿海居民生命安全及海濱旅游業(yè)的發(fā)展,在印度洋-西太平洋熱帶地區(qū),劇毒立方水母蜇傷甚至使游客致死的事件頻繁發(fā)生,引起了當(dāng)?shù)卣闹攸c(diǎn)關(guān)注[3-4]。僅在菲律賓沿岸的立方水母蜇死游客或漁民的發(fā)生率,每年可達(dá)20～50例,由于一些偏遠(yuǎn)地區(qū)沒有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),實(shí)際發(fā)生率應(yīng)遠(yuǎn)高于此[4]。另外,近年來由于受人類活動(dòng)及氣候變化的影響,水母數(shù)量劇增引發(fā)的重大事件在全球范圍內(nèi)頻繁爆發(fā),例如:水母爆發(fā)堵塞發(fā)電廠的冷卻系統(tǒng),導(dǎo)致中國(guó)河北、山東等多地沿海發(fā)電廠被迫臨時(shí)關(guān)閉[5-6];在日本海[7]以及地中海、大西洋等某些海域[8],近海海域水母頻繁爆發(fā)嚴(yán)重破壞了當(dāng)?shù)馗∮紊鷳B(tài)系統(tǒng)平衡,使海洋漁業(yè)大規(guī)模減產(chǎn),造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,掌握水母種群和數(shù)量的動(dòng)態(tài)分布與變化,尤其是對(duì)有毒水母進(jìn)行快速鑒別和區(qū)分具有重要意義。

然而,僅依據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)來鑒別和區(qū)分不同的水母種類存在一定的局限性,不能直接應(yīng)用于水母生物多樣性和種群監(jiān)測(cè)等的研究中。首先,目前水母的分類系統(tǒng)還不夠完善,一些種類原始標(biāo)本的遺失、形態(tài)描述不充分、隱種(Cryptic species)的存在等,使得一些水母科屬還未明確其分類地位[9];隨著研究的深入,一些新的水母種類不斷被發(fā)現(xiàn)[10-11],但仍有許多種類沒有充分描述或正式命名[12]。其次,已有研究表明一些水母的形態(tài)特征具有不確定性,例如:不同生活史時(shí)期差異甚大[13],水母的形態(tài)在不同的海域也往往有變化。而且實(shí)際調(diào)查中的很多限制因素如樣品含水多,采集后易變形失真等,也增加了形態(tài)鑒定的難度。相對(duì)于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法,DNA條形碼的優(yōu)勢(shì)在于能以較低的成本快速獲取DNA信息,大大縮短了鑒定時(shí)間,且可以監(jiān)測(cè)水母從浮浪幼蟲到成體的全生活階段[14]。

自20世紀(jì)90年代開始,隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,一些水母類的核糖體基因和線粒體基因片段也逐漸被開發(fā),并應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究[15-17]。線粒體DNA具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、堿基替換率高、無組織特異性等優(yōu)點(diǎn),適于物種分類、進(jìn)化關(guān)系等的分析,其中線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I(COI)在海洋生物分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。已有的許多研究證明基于COI的DNA條形碼在物種鑒定、隱存種發(fā)現(xiàn)等方面具有強(qiáng)大的功能[18-20],這在水母研究中得到應(yīng)用[21-22]。

近年來,泰國(guó)有毒水母蜇傷游客的事故頻發(fā)[4],引起泰國(guó)政府部門的高度重視,初步調(diào)查發(fā)現(xiàn)泰國(guó)海域有毒水母多屬于立方水母綱和缽水母綱,尤其是數(shù)個(gè)劇毒的立方水母種類尚難準(zhǔn)確鑒定并區(qū)分其種類[23]。另外,這些水母生活史復(fù)雜、形態(tài)多變,嚴(yán)重影響了對(duì)其種群分布、生活史以及環(huán)境影響要素等的生態(tài)學(xué)調(diào)查研究?；谛螒B(tài)分類的不足和DNA條形碼在物種分類上的優(yōu)勢(shì),我們分析了泰國(guó)近海有毒水母COI基因片段,探討其在水母種類鑒定方面的應(yīng)用價(jià)值,以期推動(dòng)線粒體COI序列片段在泰國(guó)有毒水母種群監(jiān)測(cè)和研究中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與保存

2014-2015年,西南季風(fēng)季(5-10月)、東北季風(fēng)季(11月至翌年4月)各采樣2～3次。由于泰國(guó)近岸的劇毒水母(如立方水母)比較多,采樣工作均由當(dāng)?shù)赜薪?jīng)驗(yàn)的監(jiān)測(cè)人員和漁民負(fù)責(zé),大部分是利用大型浮游生物網(wǎng)采集,另有少量樣本來自當(dāng)?shù)貪O民的零星采集。

甄選有毒水母樣本69個(gè)用于遺傳多樣性研究,其中12個(gè)采自泰國(guó)灣西部沿岸,57個(gè)來自安達(dá)曼海東部沿岸(圖1)。取小塊傘部或觸手組織,用體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精固定,4℃保存于冰箱中,運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,2015-10開始進(jìn)行DNA分析。其余組織保存于體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醛中,用于形態(tài)學(xué)的鑒定,泰方負(fù)責(zé)的形態(tài)學(xué)研究結(jié)果另文追述,表4僅列出我們研究中69個(gè)樣品的形態(tài)鑒定相關(guān)信息。

1.2 DNA的提取以及PCR擴(kuò)增和測(cè)序

切取每個(gè)組織樣本約3 mg,用蒸餾水沖洗數(shù)次,無菌濾紙汲取樣品中的水分后,用滅菌刀片將組織切碎并研磨,使用動(dòng)物組織DNA提取試劑盒(美國(guó)Omega Bio-Tek公司生產(chǎn)E.Z.N.A.TM型)提取基因組DNA[24]。

PCR擴(kuò)增在PCR儀(杭州博日科技有限公司生產(chǎn)Gene Touch型)上進(jìn)行,COI反應(yīng)體系為50μL,包括5μL 10×buffer,4μL Mg2+(25 mmol/L),4μL d NTP(10 mmol/L),2μL每條引物(10μmol/L),0.25 U Taq酶(大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)),0.75μL BSA(10 mg/m L,牛血清白蛋白),2μL基因組DNA模版(約50 ng),其余用超純水補(bǔ)足。擴(kuò)增COI片段的反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2 min,然后35個(gè)循環(huán)包括94℃變性45 s,48℃退火60 s,72℃延伸2 min,最后72℃延伸10 min。反應(yīng)引物(表1)主要使用引物CNCOXF/R擴(kuò)增,效果不佳時(shí),采用其他2對(duì)引物擴(kuò)增。

圖1 采集地點(diǎn)和樣品數(shù)量(括號(hào)內(nèi)數(shù)字)Fig.1 The collecting locations and sample sizes(numbers in brackets)

表1 所用引物序列及參考文獻(xiàn)Table 1 Sequences and references of the primers used in the study

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),驗(yàn)證無誤后使用割膠回收試劑盒(美國(guó)Omega Bio-Tek公司生產(chǎn)E.Z.N.A.TM型)進(jìn)行回收純化[24]。純化產(chǎn)物直接送青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司使用PCR引物雙向測(cè)序。部分測(cè)序困難的樣品采用PMD TM 19-T(大連寶生物工程有限公司生產(chǎn))連接,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α,采用麥康凱選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆,經(jīng)PCR檢測(cè)確認(rèn)無誤后,選擇4～5個(gè)陽性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得原始峰圖文件先經(jīng)Seqman軟件(DNAstar軟件包)處理,進(jìn)行序列拼接,并人工校正。使用Bioedit v7.0.9.0軟件中內(nèi)置的Clustal W對(duì)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,參數(shù)為默認(rèn)值。所得序列去除引物和兩端質(zhì)量不高的部分,并雙向進(jìn)行比對(duì),對(duì)于正反向存在不一致的序列,會(huì)重復(fù)測(cè)序,以確定正確的序列。部分樣品進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化后測(cè)序,所得的重復(fù)序列進(jìn)行比對(duì),并以一致共有的序列作為該樣品的代表性序列,與其它樣品進(jìn)行比較。研究中獲得水母COI片段69條,結(jié)合從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的19條相關(guān)代表性COI序列(表2),對(duì)所得樣品進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究。比對(duì)后,去除兩端較長(zhǎng)的序列,保留621 bp可比對(duì)位點(diǎn)。使用MEGA 6.0軟件統(tǒng)計(jì)堿基組成、堿基替換。計(jì)算基于K2P(Kimura 2-parameter)模型的樣品間相對(duì)遺傳距離(d),并按各樣品的分類組別分別統(tǒng)計(jì)和比較種內(nèi)、種間和綱間遺傳距離的變化。利用無脊椎動(dòng)物線粒體遺傳密碼翻譯COI核苷酸序列,并與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì),尋找正確的翻譯密碼框;兩兩比較不同序列間轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)量和轉(zhuǎn)換/顛換比值(R),進(jìn)一步分析R值與d之間的關(guān)系;分別計(jì)算密碼子不同位點(diǎn)(第1,2,3位點(diǎn))上的堿基含量、替換頻率、R值,以及與d的關(guān)系。分別采用鄰接法NJ(Neighbor-joining)和最大似然法ML(Maximum Likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。鄰接法通過確定距離最近或相鄰的成對(duì)分類單位來使系統(tǒng)樹的總距離達(dá)到最小,而最大似然法根據(jù)堿基替換模型計(jì)算每個(gè)系統(tǒng)樹的似然值,以似然率最大的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)作為最優(yōu)樹,2種方法所建的系統(tǒng)樹可相互比較印證,并用1 000次bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹各節(jié)點(diǎn)的可信度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

分別統(tǒng)計(jì)各綱中COI序列的GC含量(%)及標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE),并利用SPSS16.0軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA)方法,檢驗(yàn)不同綱之間GC含量是否具有顯著差異。為檢驗(yàn)不同樣本間(種內(nèi)、種間和綱間)R值是否趨于飽和,做R值隨著遺傳距離(d)增加而變化的散點(diǎn)圖,并利用多項(xiàng)式回歸模型做出兩者之間的趨勢(shì)線。

表2 從Genebank下載的水母COI基因序列信息,包括序列號(hào)、種類和資料來源Table 2 Information of the COI sequences retrieved from the GenBank database,including accession numbers,species and the references

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因序列堿基組成與替換統(tǒng)計(jì)分析

3個(gè)綱(缽水母、立方水母、水螅水母)的GC含量平均分別為37.1%(標(biāo)準(zhǔn)誤差SE=0.3)、42.1%(SE=0.2)、36.9%(SE=2.2),并且不同綱間差異顯著(one-way ANOVA,P＜0.01),立方水母的COI序列GC含量明顯高于缽水母和水螅水母(表3)。3個(gè)密碼子位點(diǎn)的堿基組成差異也較大,第1位點(diǎn)較高,平均為47.4%,第2位點(diǎn)次之,為42.1%,第3位點(diǎn)最低,為30.2%,且3個(gè)綱的趨勢(shì)一致?？梢?密碼子堿基使用頻率存在明顯的偏向性。

總共621 bp比對(duì)位點(diǎn)中,保守位點(diǎn)C(Conserved sites)322個(gè),約占總數(shù)的51.9%;變異位點(diǎn)V(Variable sites)299個(gè),其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)Pi(Parsim-info sites)293個(gè),自裔位點(diǎn)Si(Singleton sites)6個(gè),分別占47.2%,1.0%。進(jìn)一步對(duì)密碼子各位點(diǎn)分別進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):堿基替換主要發(fā)生在密碼子的第3位點(diǎn),總共299個(gè)變異位點(diǎn)中,128個(gè)發(fā)生在第3位點(diǎn)上,占總變異位點(diǎn)的42.8%;對(duì)比密碼子第1,2位點(diǎn),第3位點(diǎn)顛換的發(fā)生頻率較高,轉(zhuǎn)換與顛換的比值(R)為1.00;密碼子第1,2位點(diǎn)的堿基替換頻率分別為4.19%,0.97%,R值分別是1.43,0.37。3個(gè)綱間的R值波動(dòng)較大,立方水母和水螅水母的轉(zhuǎn)換明顯高于顛換,R值分別為1.34,1.33,缽水母的COI序列中,顛換較多,R值為0.93。

表3 COI基因片段GC含量(%)和轉(zhuǎn)換/顛換比值(R)Table 3 G and C nucleotide composition(%)and Ts vs.Tv(R)of partial COI sequences

2.2 遺傳距離計(jì)算

以K2P模型計(jì)算COI序列之間遺傳距離,按照分類階元進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖2)。種內(nèi)差異明顯小于種間和綱間差異。在種內(nèi),COI序列的差異為0.000～0.151(平均為0.036),中位數(shù)為0.006。同綱種間,序列差異為0.167～0.321(平均0.263)。不同的綱間遺傳差異為0.246～0.385(平均為0.334)。同綱種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的7.3倍,而不同綱間的遺傳距離是種內(nèi)的9.3倍(圖2)。

進(jìn)一步分析密碼子不同位點(diǎn)的堿基突變與遺傳距離估算之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)遺傳距離d＜0.100時(shí),序列間轉(zhuǎn)換/顛換比值(R)波動(dòng)較大,且密碼子第3位點(diǎn)的R值明顯低于3個(gè)位點(diǎn)的綜合結(jié)果;遺傳距離d＞0.150時(shí),R值較小,且波動(dòng)不大,第3位點(diǎn)的R值與綜合密碼子3個(gè)位點(diǎn)的結(jié)果無明顯區(qū)別(圖3)。

圖2 水母COI序列不同分類階元水平的遺傳距離(d)范圍箱式圖Fig.2 Boxplot on the range of pairwised genetic distances(d)at the levels of intra-,inter-species and among classes

圖3 R值與遺傳距離(d)的散點(diǎn)圖Fig.3 Estimated R values plotted as a function of the genetic distance(d)from pairwise comparisons of COI genes

2.3 基于COI序列的系統(tǒng)樹分析

用NJ和ML法對(duì)本研究所得69條COI序列及19條Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中代表性序列(表2)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,2種方法所得的進(jìn)化樹基本一致(圖3):88條序列可以分為3大組,39條序列與6條立方水母綱下載序列(FJ665180,KT223648,JN642335,JN700970,HQ824530,JN700960)組成立方水母綱(Cubozoa);另有26條本研究所得序列和9條下載序列聚合在一起,形成缽水母綱(Scyphozoa);其余8條序列聚成水螅水母綱(Hydrozoa)。缽水母綱可進(jìn)一步分為5個(gè)獨(dú)立分支(圖4),立方水母亦可分成6個(gè)分支,分別代表本研究中所檢測(cè)獲得的不同種類。去除突變率較高的密碼子第3位點(diǎn),僅根據(jù)第1,2位點(diǎn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),結(jié)果與保留所有位點(diǎn)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本相同。

2.4 泰國(guó)有毒水母的種類及分布

對(duì)研究中69個(gè)泰國(guó)近海常見有毒水母樣本的分類及分布范圍的統(tǒng)計(jì)見表4。缽水母綱26個(gè)樣品中共有5個(gè)種:金黃水母(Chrysaora sp.)、海月水母(Aurelia sp.)、珍珠水母(Phyllorhiza puncatata)、沙海蜇(Stomolophus meleagris)和端棍水母(Catostylus sp.);立方水母綱39個(gè)樣品,分別屬于3科(Carukiidae,Chirodropidae和Chiropsalmidae),6個(gè)種(表4);水螅水母樣品共有4個(gè),屬于2個(gè)種:多管水母(Aequorea sp.)和僧帽水母(Physalia sp.)。Chiropsoides buitendijki存在種內(nèi)分化,根據(jù)COI序列,20個(gè)樣本明顯分為2個(gè)群體(圖4和圖5),而這2個(gè)群體的18S序列完全一致[23],屬于同一種,其COI序列的分化代表種內(nèi)不同遺傳群體間的差異。金黃水母、Chiropsoides buitendijki數(shù)量較多,且分布范圍較廣,在安達(dá)曼海和泰國(guó)灣均有分布。

圖4 基于COI序列的系統(tǒng)樹(括號(hào)外為ML法檢驗(yàn)值,括號(hào)內(nèi)為NJ法檢驗(yàn)值)Fig.4 Phylogenetic tree based on COI sequences(bootstrapping support values of MJ tree are labeled outside the brackets and values of NJ tree are inside the brackets)

2.5 立方水母綱新種的發(fā)現(xiàn)

立方水母綱Carukiidae科的16個(gè)樣本分為4個(gè)小支,結(jié)合16S和18S數(shù)據(jù)[23],其中7個(gè)樣本(NO.C1～NO.C6,NO.L3)屬于Morbakka屬;其余9個(gè)樣本與該科內(nèi)已知的4個(gè)屬(Malo,Morbakka,Gerongia和Carukia)存在明顯的遺傳分化,結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)(Charatsee Aungtonya和肖潔未發(fā)表數(shù)據(jù)),這9個(gè)樣本組成一新屬,并可分為2個(gè)新種(表4)。然而,GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于立方水母的基因數(shù)據(jù)不夠完整,目前已有基因數(shù)據(jù)的種類數(shù)量不足總數(shù)的40%[38],而東南亞熱帶地區(qū)立方水母的序列數(shù)據(jù)尤為匱乏,一些樣本僅依賴分子序列,并不能完全確定其種屬地位,需要結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。在后續(xù)研究中,我們將與泰方研究人員合作,對(duì)一些新種進(jìn)行逐個(gè)描述和命名。

圖5 基于COI序列的系統(tǒng)樹(只包含密碼子第1,2位點(diǎn))Fig.5 Phylogenetic tree based on COI sequences with only 1st,2nd condon positions included

表4 泰國(guó)沿海有毒水母種類和分布范圍Table 4 Species and distribution of the venomous jellyfish collected from the coasts of Thailand

3 討 論

我們對(duì)采自于泰國(guó)沿海的69個(gè)有毒水母樣本的線粒體COI基因片段進(jìn)行分析,堿基組成分析結(jié)果表明,3個(gè)綱線粒體COI基因的GC含量都小于50%,這符合后生動(dòng)物的線粒體基因組堿基組成的特點(diǎn)[39],立方水母的GC含量顯著高于缽水母和水螅水母綱,這與前人的結(jié)果[27]基本一致。3個(gè)密碼位點(diǎn)的堿基組成結(jié)果表明,密碼子第3位點(diǎn)的GC含量最小,這表明COI序列核苷酸堿基構(gòu)成出現(xiàn)了明顯的偏倚現(xiàn)象;并且,密碼子第3位點(diǎn)的堿基替換速率明顯高于第1,2位點(diǎn),符合氨基酸編碼基因第3位點(diǎn)進(jìn)化最快的規(guī)律[40];該位點(diǎn)上,轉(zhuǎn)換與顛換比值(R)也低于第1,2位點(diǎn),尤其是水螅水母和缽水母,R＜2(表3),說明該位點(diǎn)上堿基突變已趨于飽和(圖3)。為減少由于堿基突變過飽和,而低估物種之間的遺傳差異,我們采用2種方法(保留所有位點(diǎn)和只包含密碼子第1,2位點(diǎn))構(gòu)建COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明2種方法所得的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致(圖4和圖5),說明密碼子第3位點(diǎn)的高突變率未對(duì)遺傳距離的估算和遺傳關(guān)系分析造成明顯影響,該段基因適用于不同水平的物種區(qū)分和進(jìn)化樹構(gòu)建。

通過COI基因片段的序列分析,在泰國(guó)沿海采集的69個(gè)有毒水母樣本可區(qū)分為13個(gè)種,在綱的水平上,利用分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)手段所得的結(jié)果一致,但在種的水平上存在一些差異(表4),例如:缽水母綱中,有9個(gè)樣品被鑒定為同一種向心水母(Lychnorhiza sp.),然而根據(jù)其COI序列可分為3種,分別為海月水母(Aurelia sp.)、端棍水母(Catostylus sp.)和金黃水母(Chrysaora sp.)。立方水母綱中有16個(gè)樣本被鑒定為Morbakka sp.,但其COI基因序列存在明顯分化,可分為3個(gè)獨(dú)立分支。結(jié)合18S與16S基因結(jié)果[23],其中一支與來自于日本的Morbakka virulenta[38]相近,雖然18S基因與M.virulenta一致,但16S與COI基因存在明顯差異,16S遺傳距離為0.000～0.050,均值為0.009[23],研究中COI遺傳距離為0.000～0.151,均值為0.036;另外,該水母的足葉管等形態(tài)特征(Charatsee Aungtonya未發(fā)表數(shù)據(jù))與已知的M.virulenta和M.fenner[41]不同;因此,該水母可能為Morbakka屬中的新種。另2個(gè)分支也屬于Carukiidae科,但16S和18S序列數(shù)據(jù)表明其與該科內(nèi)已知的4個(gè)屬(Malo,Morbakka,Gerongia和Carukia)明顯不同[23,40,42];形態(tài)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其眼點(diǎn)(rhopalia)形狀和假緣膜(velarium)花紋比較特殊(Charatsee Aungtonya未發(fā)表數(shù)據(jù))[42],也與該科內(nèi)的其他4個(gè)屬不同,因此,該水母為Carukiidae科中的新屬,系統(tǒng)的形態(tài)描述和種屬的建立正在進(jìn)行中。上述結(jié)果也表明,研究所用的線粒體COI基因片段,可以有效區(qū)分泰國(guó)沿海常見的水母種類,這種基于線粒體COI基因片段的DNA條形碼技術(shù)可以為后續(xù)有毒水母種類的生活史、監(jiān)測(cè)和生態(tài)學(xué)等方面的研究提供快捷有效的技術(shù)手段。

4 結(jié) 語

我們利用線粒體COI序列對(duì)泰國(guó)沿海習(xí)見有毒水母進(jìn)行遺傳多樣性分析,研究表明泰國(guó)沿海水母多樣性較高,其中劇毒的立方水母有5種,且立方水母的地理分布呈明顯的區(qū)域特征。例如:Chiropsoides buitendijk明顯分為2個(gè)遺傳群體(圖4和圖5),其中一個(gè)群體集中于攀牙府(Phany-nga Province)的Panwa Bay,而另一個(gè)群體在安達(dá)曼海東部沿岸和泰國(guó)灣均有分布;Carukiidae科新屬中的2個(gè)相近種,一種只出現(xiàn)于安達(dá)曼海東部沿岸,另一種在泰國(guó)灣和安達(dá)曼海東部沿岸均有發(fā)現(xiàn),而Morbakka sp.也只在泰國(guó)灣沿岸發(fā)現(xiàn)。與泰國(guó)灣海域相比,安達(dá)曼東部沿岸的水母多樣性更高,其中,攀牙府附近海域的水母多樣性最高,約有8種。我們的研究中來自安達(dá)曼東部沿海的樣本數(shù)量高于泰國(guó)灣的,這可能對(duì)評(píng)估2個(gè)海域的物種遺傳多樣性產(chǎn)生一定的影響,后續(xù)研究中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)泰國(guó)灣海域的樣品采集和分析。然而,一些種類或群體呈明顯的局域性分布,結(jié)合往年對(duì)于泰國(guó)近岸有毒水母分布的調(diào)查數(shù)據(jù)[43]分析,馬來半島(Malay Peninsula)東西兩岸的水母存在物種和遺傳多樣性差異。這種差異是否在浮游生物中普遍存在,是否是2海域的地理隔離造成的,有待于進(jìn)一步研究。

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Genetic Diversity of the Venomous Medusae in Thai Waters Based on the Mitochondrial COI Gene Sequences

MIAO Xiao-xiang1,2,XIAO Jie1,2,ZHANG Xue-lei1,2,LIU Rui-juan1,2,AUNGTONYA Charatsee3
(1.The First Institute of Oceanography,SOA,Qingdao 266061,China;2.Key Laboratory of Science and Engineering for Marine Ecology and Environment,SOA,Qingdao 266061,China;3.Phuket Marine Biological Center,Phuket 83000,Thailand)

To explore the genetic diversity of the venomous medusae,the partial mitochondrial COI gene sequences were generated from 69 jellyfish specimens collected from the coastal waters of Thailand.And the feasibility of DNA barcoding using this gene fragment was further investigated,in order to provide technique supporting for the early warning of venomous medusae in Thailand,and for the future work on ecology and biology of these venomous jellyfish as well.The analysis of nucleotide composition of the sequences showed that G and C nucleotide percentage(GC%)of Cubozoa(42.1%)was significantly higher than those of Scyphozoa(37.1%)and Hydrozoa(36.9%).GC%of the 3rd condon position(30.2%)was much lower than those of the 1st and 2nd positions(47.4%and 42.1%,respectively).Besides,the frequency of nucleotide substitution was highest at the 3rd positions with the R value(transition/transversion)of 1.0,indicating that the mutational rate at this position was prone to be saturated.Whereas,the topology of the phylogenetic tree was not significantly changed after the 3rd condon positions were excluded from the analyses.The K2P(Kimura 2-parameter)genetic distance was evaluated within and among the species based on the sequences of COI gene.The intra-specific genetic distances ranged from 0.000 to 0.151,with the average of 0.036;the inter-specific distances varied from 0.167 to 0.321,with the average of 0.263,and inter-classes were from 0.246 to 0.385 with the average of 0.334.The COI gene fragments were proved to be able to discriminate these venomous jellyfish species fast and efficiently.Additionally,a high species diversity of the venomous jellyfish along the coasts of Thailand was revealed by this research.There were total 13 species identified from the 69 samples,including 5 Cubozoa species,6 scyphozoans and 2 hydrozoans.A new genus of the family Carukiidae was suggested by this study.A regional distribution pattern of the cubozoan jellyfish in Thai waters was observed,which showed the species and genetic divergence between east and west coasts of Malaya Peninsula.It needs further investigation whether there is a geographic barrier for the divergence between these two regional groups of cubozoan jellyfish.

Cubozoa;Scyphozoa;DNA barcoding;COI sequences;Thailand

September 1,2016

Q344

A

1671-6647(2017)04-0535-12

10.3969/j.issn.1671-6647.2017.04.010

2016-09-01

中國(guó)-東盟海上合作基金項(xiàng)目——瀕危海洋物種合作研究;國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目——我國(guó)海水甲殼類中寄生性甲藻(Hematodinium)的種群遺傳結(jié)構(gòu)及其分子系統(tǒng)分類地位的研究(41206162)

繆曉翔(1991-),女,江蘇南通人,碩士研究生,主要從事近海水母和大型藻類的生態(tài)學(xué)方面研究.E-mail:miaoxiaoxiang@fio.org.cn

*通訊作者:張學(xué)雷(1973-),男,山東淄博人,博士,研究員,主要從事海洋生物、環(huán)境科學(xué)和生態(tài)學(xué)方面研究.E-mail:zhangxl@fio.org.cn

(高 峻 編輯)