● 王振飛 賈永峰 牟永平 楊永燕 李景權(quán)

雷公藤內(nèi)酯酮抑制胃癌細(xì)胞惡性行為的作用與機(jī)理研究※

● 王振飛1賈永峰1牟永平1楊永燕1李景權(quán)2▲

目的：觀察雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)人胃癌細(xì)胞惡性行為的抑制作用，并初步探討其作用機(jī)理。方法：CCK-8法檢測(cè)雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)BGC 823胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，軟瓊脂集落形成法檢測(cè)雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)BGC 823細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)能力的影響，熒光定量PCR法檢測(cè)雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)BGC 823細(xì)胞中piRNA651表達(dá)的影響。結(jié)果：雷公藤內(nèi)酯酮顯著地抑制了BGC 823細(xì)胞的增殖能力，IC50為165.17 nmol/L；當(dāng)濃度等于或大于100 nmol/L時(shí)，雷公藤內(nèi)酯酮有效地抑制了BGC 823細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)能力；雷公藤內(nèi)酯酮有力地下調(diào)了BGC 823細(xì)胞中piRNA651的表達(dá)。結(jié)論：雷公藤內(nèi)酯酮可以降低胃癌細(xì)胞中促癌的非編碼RNA的表達(dá)，使其惡性行為受到顯著抑制，在胃癌的治療上具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

雷公藤內(nèi)酯酮 胃癌 增殖 錨定非依賴性生長(zhǎng) piRNA

我國(guó)是胃癌的高發(fā)國(guó)家，每年新發(fā)病例占全球的50%[1]。很多胃癌患者早期無(wú)明顯癥狀，就診時(shí)已處于中晚期，治療以藥物為主。常規(guī)化療藥物效果有限，毒副作用巨大，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高[2]。亟需開(kāi)發(fā)出高效的、無(wú)毒的新型抗胃癌藥物，以貢獻(xiàn)于人類。

中國(guó)醫(yī)藥學(xué)博大精深，尤其在腫瘤治療方面，經(jīng)過(guò)幾千年的臨床實(shí)踐，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，很值得深入發(fā)掘，加以提高。雷公藤是一味傳統(tǒng)中藥，味苦，性涼，有活血通絡(luò)、破瘀鎮(zhèn)痛之功效[3]。雷公藤內(nèi)酯酮是從雷公藤中分離出的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，它在較高的劑量下對(duì)肝臟、腎臟等器官均無(wú)毒性作用[4]，也不會(huì)降低血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞的數(shù)量[5]，顯示出很高的安全性。以往對(duì)它的研究多集中于免疫抑制、抗炎和抗生育等方面[6，7]。對(duì)其抗腫瘤活性的報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)中，我們首次觀察了雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，并從改變促癌的非編碼小RNA表達(dá)的角度探討了它的作用機(jī)理。

1 材料

1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞BGC 823購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2試劑雷公藤內(nèi)酯酮由陜西辰光生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)：20151125，純度>98%，溶于二甲基亞砜(DMSO)，配成濃度為100mmol/L的貯存液。胎牛血清(10099133)、RPMI-1640培養(yǎng)液(11875093)、胰蛋白酶消化液(25200056)、DMSO(1572C502)均購(gòu)自Gibco公司，CCK-8試劑盒(C16038)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，低熔點(diǎn)瓊脂糖(358608)購(gòu)自santacruze公司，小RNA提取試劑盒EasyPure miRNA Kit(J21204)、miRNA反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix(AQ202-01)均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)，超凈工作臺(tái)(蘇州金燕)，倒置相差顯微鏡(Nikon TE2000)，多功能酶標(biāo)儀SpectraMax i3x(Molecular Devices)，7500 Real-Time PCR Systems(Applied Biosystem)。

2 方法

2.1胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞BGC 823培養(yǎng)于含10%胎牛血清、0.1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基(完全RPMI-1640培養(yǎng)基)中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將BGC 823細(xì)胞懸于完全RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為2×104個(gè)/ml，接種于96孔板(0.2ml/孔)。培養(yǎng)24h后，藥物組加入雷公藤內(nèi)酯酮(終濃度為50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L)，對(duì)照組加入DMSO。繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入CCK-8溶液20μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h。以450nm為檢測(cè)波長(zhǎng)、以650nm為參考波長(zhǎng)，測(cè)定吸光度。計(jì)算相對(duì)增殖率(藥物組吸光度/對(duì)照組吸光度)。

2.3軟瓊脂集落形成法檢測(cè)細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)能力向6孔板每孔中加入1ml含0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖的完全RPMI 1640培養(yǎng)液，搖勻后4℃靜置5min。將104個(gè)細(xì)胞懸于0.5ml含0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖的完全RPMI 1640培養(yǎng)液中，藥物組加入雷公藤內(nèi)酯酮(終濃度分別為50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L)，對(duì)照組加入DMSO，覆于底層瓊脂糖之上。37℃、5%CO2培養(yǎng)3周，在顯微鏡下計(jì)大于100μm的集落數(shù)。

2.4熒光定量PCR法檢測(cè)piRNA651表達(dá)水平BGC 823細(xì)胞傳代培養(yǎng)24h后，藥物組加入雷公藤內(nèi)酯酮(終濃度分別為50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L)，對(duì)照組加入DMSO，作用48h后，使用EasyPure miRNA Kit 試劑盒提取RNA，使用TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光定量PCR條件為：94℃ 30s，(94℃ 5s，60℃ 34s)×40個(gè)循環(huán)。所用引物序列為：piRNA651上游引物5’-AGAGAGGGGCCCGTGCCTTG-3’，piRNA651下游引物Universal miRNA qPCR primer；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6下游引物Universal miRNA qPCR primer。以U6為內(nèi)參，采用2-DDCt法計(jì)算piRNA651的相對(duì)表達(dá)量。

2.5統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1雷公藤內(nèi)酯酮抑制BGC 823細(xì)胞的增殖能力CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)BGC 823 細(xì)胞的增殖能力具有顯著的抑制作用，并呈明顯的劑量依賴性，IC50為165.17nmol/L。見(jiàn)圖1。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2雷公藤內(nèi)酯酮抑制BGC 823細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)能力軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)濃度等于或大于100nmol/L時(shí)，雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)BGC 823細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)能力具有顯著的抑制作用，尤其當(dāng)濃度達(dá)到250nmol/L時(shí)，BGC 823細(xì)胞生長(zhǎng)形成集落的能力完全喪失。見(jiàn)表1。

表1 雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)BGC 823細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)能力的影響

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.3雷公藤內(nèi)酯酮抑制BGC 823細(xì)胞中piRNA651的表達(dá)熒光定量PCR結(jié)果顯示，雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)BGC 823細(xì)胞中piRNA651的表達(dá)具有顯著的抑制作用。見(jiàn)表2。

表2 雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)BGC 823細(xì)胞中piRNA651表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組相比，**P<0.01。

4 討論

雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬一年生藤本植物，在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中有著悠久的藥用歷史，在臨床上對(duì)多種腫瘤都顯示了良好的治療效果。但其嚴(yán)重的的毒副作用，限制了它在臨床上的應(yīng)用[8]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的提高，從雷公藤中分離純化出了一系列單體，其中是否有抗腫瘤活性高、毒副作用低的單體，是一個(gè)值得深入研究的問(wèn)題。已有的工作主要集中在雷公藤甲素和雷公藤紅素[9，10]這兩種物質(zhì)上，發(fā)現(xiàn)它們雖有較好的抗腫瘤活性，但對(duì)肝臟、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等會(huì)產(chǎn)生較大的毒性作用[11，12]。從雷公藤中分離出的雷公藤內(nèi)酯酮，與雷公藤甲素和雷公藤紅素的分子結(jié)構(gòu)不同，所產(chǎn)生的藥理作用也有差異。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：它對(duì)肝臟、腎臟和血液系統(tǒng)均無(wú)毒性作用[4，5]。對(duì)于雷公藤內(nèi)酯酮是否具有抗胃癌活性，迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次選用雷公藤內(nèi)酯酮作用于胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它可以有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力和錨定非依賴性生長(zhǎng)能力，可以有力抑制胃癌細(xì)胞中促癌的非編碼RNA的表達(dá)。這說(shuō)明雷公藤內(nèi)酯酮有望成為一種安全、高效的抗胃癌藥物。

非編碼RNA表達(dá)的異常是胃癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要原因。piRNA是近年新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA，長(zhǎng)度25-36個(gè)核苷酸，它們?cè)谡{(diào)控轉(zhuǎn)座因子活動(dòng)、染色質(zhì)完整性、DNA甲基化、mRNA穩(wěn)定性等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。在肝癌[14]、胃癌[15]和乳腺癌[16]中，已發(fā)現(xiàn)一些piRNA的表達(dá)異常升高，使得抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生超甲基化而引起轉(zhuǎn)錄失活，使得癌基因mRNA的降解受到抑制而增強(qiáng)其翻譯活動(dòng)，從而有力地促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究證實(shí)：piRNA651在胃癌組織中處于高表達(dá)狀態(tài)，極大地促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖活動(dòng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯酮可以下調(diào)胃癌細(xì)胞中piRNA651的表達(dá)，這為闡明雷公藤的抗癌機(jī)理提供了一條新途徑。

很多有抗腫瘤活性的中藥，都有一定的毒副作用，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。但是，每味中藥都是一個(gè)天然的化合物庫(kù)，其中含有很多種活性物質(zhì)，每種活性物質(zhì)的毒性和藥理作用是各不相同的，對(duì)它們進(jìn)行細(xì)致的篩選，并加以針對(duì)性的研究，是可以尋找到低毒、甚至無(wú)毒，同時(shí)又有較好抗腫瘤活性的物質(zhì)的，進(jìn)而開(kāi)發(fā)出屬于我們中華民族自己的、具有獨(dú)特療效的抗腫瘤新藥，造福于人類。

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國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81760552)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(No.2016MS0824)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(No.NMGIRT-A1604)

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李景權(quán)，男，助理研究員。主要研究方向：藥學(xué)。E-mail：wzfsub12@126.com

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)(010020)；2.巴彥淖爾市食品藥品檢驗(yàn)所(015000)