許抗抗，丁天波，嚴毅，李燦，楊文佳*

（1.貴陽學院生物與環(huán)境工程學院/貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟昆蟲重點實驗室，貴陽550005；2.青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院，山東青島266109）

CO2氣調脅迫下煙草甲谷胱甘肽S-轉移酶基因的表達分析

許抗抗1，丁天波2，嚴毅1，李燦1，楊文佳1*1

（1.貴陽學院生物與環(huán)境工程學院/貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟昆蟲重點實驗室，貴陽550005；2.青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院，山東青島266109）

根據(jù)煙草甲（Lasioderma serricorne）轉錄組數(shù)據(jù)信息，克隆獲得3個谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferases，GSTs）基因的cDNA全長序列，同源性比對和系統(tǒng)進化分析表明，這3個基因分別屬于GSTs基因Theta、Delta和 Sigma家族，分別命名為 LsGSTt1、LsGSTd1和 LsGSTs1（GenBank登錄號：KY549655、KY549656和KY549657），并分析了其在煙草甲不同發(fā)育階段和CO2氣調脅迫后的表達特征，為研究煙草甲GSTs基因的生物學功能提供依據(jù)。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）結果顯示：煙草甲LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1基因在不同發(fā)育階段均有表達，且在低齡幼蟲中表達量最高，顯著高于其他時期；經(jīng)LC10、LC30和LC503種CO2濃度處理低齡幼蟲6 h后，煙草甲LsGSTd1表達量相對于對照組無明顯變化，而LsGSTt1和LsGSTs1表達量顯著高于對照組，推測這2個基因可能主要參與了煙草甲對CO2氣調脅迫的應激響應。

谷胱甘肽S-轉移酶；煙草甲；基因克?。槐磉_模式

谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferases，GSTs，EC 2.5.1.18）是一種多功能的超基因家族酶，廣泛存在于微生物、植物和動物等生物體內[1]。GSTs作為重要的次級代謝酶，其主要功能是降解內源性和外源性有毒物質[2]和保護細胞免受氧化損傷[3]。GSTs也會參與生物體內其他生理途徑，例如細胞內物質的運輸和儲存[1]、細胞信號通路的調節(jié)[4]以及嗅覺調控[5]等。根據(jù)其底物特異性、同源性和免疫反應，可將昆蟲GSTs分為7個家族，即Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta 6個已知家族及未知家族[6]。目前，已有多種昆蟲GSTs基因被克隆鑒定，研究發(fā)現(xiàn)，它們在殺蟲劑抗性[7-8]、激素合成[9]和抗氧化應激[10]過程中發(fā)揮著重要作用。

煙草甲[Lasioderma serricorne(Fabricius)]，屬鞘翅目（Coleoptera）竊蠹科（Anobiidae），其寄主范圍廣泛，可危害煙草、糧食、茶葉、中藥材等多種儲藏物，是一種世界性分布的倉儲害蟲[11]。煙草甲主要通過幼蟲潛居寄主體內進行蛀食，嚴重影響儲藏物的產(chǎn)量和品質，其發(fā)生危害具有較強的隱蔽性[12]。目前煙草甲的防治主要以化學藥劑熏蒸為主，不僅對食品安全和人類安全存在隱患，而且導致煙草甲對殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，因此，需要探索新的倉儲害蟲防治策略[13]。CO2氣調技術具有安全、有效、無殘留等特點，在倉儲害蟲防治中應用廣泛[14-15]。已有研究表明，CO2氣調處理可以有效控制煙草甲危害，但不同濃度CO2對煙草甲的毒理作用不同，其中高濃度CO2對煙草甲的控制效果更佳[16]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CO2氣調處理后煙草甲體內GSTs酶活性顯著升高，推測GSTs在害蟲應對氣調脅迫過程中起著重要作用[17]。目前有關GSTs參與CO2氣調脅迫應激響應的分子機制研究較少，因此，鑒定煙草甲GSTs基因并研究其與氣調脅迫之間的關系，對于防治倉儲害蟲具有重要的理論和實踐意義。

本研究以轉錄組測序獲得的GSTs序列為基礎，應用反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR）技術克隆了煙草甲3條不同家族GSTs基因的cDNA全長序列，并對這些基因的分子特性進行了分析。利用實時熒光定量PCR技術分析了煙草甲體內GSTs基因在不同發(fā)育階段和CO2氣調脅迫后的表達特性，為研究GSTs基因在煙草甲體內的功能奠定基礎，也為闡明昆蟲在氣調脅迫下的應激機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究所用煙草甲種群于2010年采自貴州省貴陽市，將其置于溫度（28±1）℃、相對濕度（75±5）%、光照14 h、黑暗10 h的人工氣候箱內，以中藥材當歸（Angelica sinensis）為食料連續(xù)飼養(yǎng)繁殖40代以上。

1.2 總RNA提取與第1鏈cDNA合成

按照TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）說明書提取煙草甲成蟲的總RNA，利用Nanodrop 2000核酸濃度測定儀（Thermo Scientific公司，美國）和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度和完整性。取1 μg總RNA，利用DNA酶（Promega公司，美國）去除基因組DNA，并按照PrimeScript?RT試劑盒（大連寶生物工程有限公司）說明書合成第1鏈cDNA，稀釋2倍保存于－20℃冰箱備用。

1.3 基因克隆

從貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟昆蟲重點實驗室構建的煙草甲轉錄組數(shù)據(jù)庫中獲得3個GSTs基因的cDNA序列，經(jīng)BLAST分析后，采用Primer 5.0軟件設計3對全長驗證引物（表1）進行開放閱讀框的擴增。PCR反應體系為：10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（20 μmol/L）各1 μL，cDNA模板1.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，加 ddH2O 補至總體積25 μL。反應條件為：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照膠回收試劑盒（Gel Extraction Mini Kit,Omega公司，美國）說明書回收目的條帶，并連接至pGEM-T Easy載體（Promega公司，美國），再轉化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆送成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 序列分析

采用DNAMAN 6.03（Lynnon Biosoft公司，美國）對測序結果進行編輯和分析，推導的氨基酸采用BLAST工具（http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/）進行同源性比對分析。利用ProtParam（http://web.expasy.org/）和 NetNGlys 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分析編碼蛋白的理化性質和N-糖基化位點，并利用SMART程序（http://smart.emblheidelberg.de/）分析結構域。利用MEGA 5.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining）構建系統(tǒng)進化樹，各分支均進行1 000次重復檢驗[18]。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

分別收集各個發(fā)育階段的煙草甲，包括低齡幼蟲、高齡幼蟲、蛹和成蟲，每個蟲態(tài)設置4個生物學重復，每個重復40頭試蟲。參照本實驗室CO2氣調處理方法[17]，取煙草甲低齡幼蟲80頭放入培養(yǎng)盒，加入40 g當歸作為飼料，加蓋密封，通過氣調混配器，用導管通入不同濃度的CO2氣體，待CO2濃度配比達到要求后停止通氣。將培養(yǎng)盒進出氣口密封后放入人工氣候箱培養(yǎng)觀察，并統(tǒng)計不同濃度CO2處理后煙草甲的存活與死亡數(shù)。根據(jù)本課題組前期CO2氣調毒理測定結果[16]，采用2個亞致死濃度LC10（30%CO2+70%空氣）和LC30（70%CO2+30%空氣），以及致死中濃度LC50（90%CO2+10%空氣）的CO2氣調處理試蟲，6 h后挑取存活的試蟲，以相同條件下的空氣處理作為對照，每組處理設置4個重復。按照1.2節(jié)方法分別提取所有樣品的總RNA并反轉錄合成cDNA用于實時熒光定量PCR。使用Primer 3.0軟件設計特異性表達引物，內參基因采用煙草甲LsEF1α基因（GenBank登錄號：KY549658），引物序列信息如表1。實時熒光定量PCR反應體系（20 μL）為：GoTaq?qPCR Master Mix（Promega公司，美國）10 μL、ddH2O 7 μL、cDNA模板1 μL和10 μmol/L上下游引物各1 μL?；靹蚝筝p微離心，反應在CFX96TM實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）中進行，反應條件為：95℃預變性5 min；然后95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)；最后運用熔解曲線保證反應的特異性。根據(jù)2－ΔΔCT法計算LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1基因在煙草甲不同發(fā)育階段和不同濃度CO2氣調處理后的相對表達量[19]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

煙草甲不同發(fā)育階段間及CO2氣調處理間mRNA表達差異采用單因素方差分析（ANOVA），平均數(shù)的多重比對采用鄧肯新復極差法（Duncan’s multiple range test,DMRT），顯著性水平為p＜0.05，數(shù)據(jù)處理軟件采用SPSS 23.0。

2 結果與分析

2.1 LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1的克隆及序列分析

根據(jù)實驗室前期獲得的煙草甲轉錄組數(shù)據(jù)，利用RT-PCR擴增獲得3個GSTs基因的cDNA全長序列，通過同源性比對確定這3個基因分別屬于GSTs基因Theta、Delta和Sigma家族，分別命名為LsGSTt1、LsGSTd1和 LsGSTs1（GenBank登 錄 號 ：KY549655、KY549656和KY549657）。LsGSTt1開放閱讀框為564 bp，編碼187個氨基酸，預測蛋白質分子質量為22.4 kDa，理論等電點為8.54。根據(jù)NetNGlyc 1.0 Server分析結果，LsGSTt1可能存在2個N-糖基化位點，分別為N106和N111。利用SMART程序搜索，發(fā)現(xiàn)LsGSTt1具有2個保守結構域：N末端結構域（第4～80位氨基酸）和C末端結構域（第93～181位氨基酸）（圖1A）。LsGSTd1開放閱讀框為651 bp，編碼216個氨基酸，預測蛋白質分子質量為24.5 kDa，理論等電點為5.95。LsGSTd1不存在糖基化位點，其氨基酸序列第3～76位為保守的N末端結構域，第90～207位為C末端結構域（圖1B）。LsGSTs1開放閱讀框為696 bp，編碼231個氨基酸，預測蛋白質分子質量為26.2 kDa，理論等電點為5.06。LsGSTs1不存在糖基化位點，其氨基酸序列第32～101位為保守的N末端結構域，第111～213位為C末端結構域（圖1C）。

2.2 LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1的序列比對和系統(tǒng)進化分析

將LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1編碼的氨基酸序列進行BLAST比對。結果發(fā)現(xiàn)：LsGSTt1與其他昆蟲Theta家族GSTs的同源性較高，其中與墓地甲蟲（Nicrophorus vespilloides）（XP_017784965）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）（XP_008196475）和黃粉蟲（Tenebrio molitor）（AIL23552）的相似性分別為62%、59%和58%；LsGSTd1與同為鞘翅目的圣甲蟲（Oryctes borbonicus）（KRT80357）Delta家族 GSTs的同源性最高，為81%；與赤擬谷盜（T.castaneum）（XP_974273）、黃粉蟲（T.molitor）（AIL23531）以及中歐山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae）（XP_019755130）的相似性分別為79%、77%和70%；LsGSTs1與其他昆蟲Sigma家族GSTs的同源性較高，與墓地甲蟲（N.vespilloides）（XP_017775172）、白蠟窄吉?。ˋgrilus planipennis）（XP_018334284）和赤擬谷盜（T.castaneum）（XP_967475）的相似性分別為57%、56%和53%。

將上述所得的氨基酸序列與GenBank登錄的其他昆蟲（赤擬谷盜、黑腹果蠅和家蠶）的GSTs氨基酸序列進行比對，并利用MEGA 5.0中的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。結果（圖2）發(fā)現(xiàn)，上述4種昆蟲GSTs可分為6 個家族（Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta），本文克隆獲得的煙草甲LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1基因分別屬于Theta、Delta和Sigma家族，且與同為鞘翅目的赤擬谷盜親緣關系最近。

圖1 煙草甲LsGSTs基因的cDNA序列及推導的氨基酸序列Fig.1 cDNA and deduced amino acid sequences of LsGSTs in Lasioderma serricorne

圖2 煙草甲和其他昆蟲GSTs的系統(tǒng)聚類分析Fig.2 Phylogenetic analysis of GSTs from Lasioderma serricorne and other insects

2.3 LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1在不同發(fā)育階段的表達

利用實時熒光定量PCR技術對3個GSTs基因在煙草甲不同發(fā)育階段的相對表達量進行分析。結果（圖3）表明：LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1基因在煙草甲各個時期均有表達，其中LsGSTt1 mRNA在低齡幼蟲、高齡幼蟲及蛹中的表達量分別是成蟲期的31.5、7.29和4.13倍，且在低齡幼蟲期的表達量顯著高于其他發(fā)育階段（p＜0.05）；LsGSTd1 mRNA在低齡幼蟲期的表達量分別是高齡幼蟲、蛹和成蟲的 1.93、2.99和 4.16倍，且差異顯著（p＜0.05）；LsGSTs1 mRNA在低齡幼蟲、高齡幼蟲及成蟲期的相對表達量顯著高于蛹期（p＜0.05），蛹期的mRNA表達量分別為上述時期的15%、31%和64%。

圖3 煙草甲不同發(fā)育階段LsGSTs的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of LsGSTs in different developmental stages of Lasioderma serricorne

2.4 不同濃度CO2對LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1基因表達的影響

采用LC10、LC302個亞致死濃度和致死中濃度LC50的CO2氣調脅迫處理煙草甲低齡幼蟲。結果（圖4）顯示：6 h后LsGSTt1基因表達量分別為對照組的2.25、4.64和19.12倍，LC30和LC50處理組的表達量顯著高于對照組（p＜0.05）；CO2處理后LsGSTd1基因表達量與對照組表達量在統(tǒng)計學上差異不顯著（P＞0.05）；LsGSTs1 mRNA的相對表達量分別為對照的1.48、1.06和3.13倍，且在LC50氣調脅迫下，mRNA表達量顯著高于對照、LC10及LC30處理（p＜0.05），但對照、LC10及LC30處理間mRNA相對表達量的差異并不顯著。

3 討論

昆蟲GSTs是一類多功能超基因家族酶系，在內源和外源化合物的解毒代謝、防御氧化、激素合成等生命活動過程中發(fā)揮著重要作用[7,9-10]。隨著昆蟲基因組計劃開展以來，多種昆蟲不同家族GSTs基因被陸續(xù)克隆，如岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）[20]、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）[21]、家蠶（B.mori）[6]、赤擬谷盜（T.castaneum）[22]等。轉錄組測序也為昆蟲GSTs基因的鑒定提供了方便，研究人員分別從斜紋夜蛾（Spodoptera litura）[23]、飛蝗（Locusta migratoria manilensis）[24]、搖蚊（Chironomus tentans）[25]和橘小實蠅（Bactrocera dorsalis）[8]的轉錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定獲得了8、10、11和17個GSTs基因，為深入研究GSTs基因的生物學功能奠定了基礎。本研究在煙草甲轉錄組測序基礎上，通過RT-PCR技術克隆獲得3個GSTs基因的cDNA全長序列，經(jīng)與其他昆蟲GSTs氨基酸進行序列比對和聚類分析，發(fā)現(xiàn)3個煙草甲GSTs分別歸屬于Delta、Theta和Sigma家族。其中Delta是昆蟲所特有的家族，在多種殺蟲劑的代謝和昆蟲抗藥性形成過程中起著重要作用[26]，Theta和Sigma家族GSTs在昆蟲中廣泛分布，可能發(fā)揮著基本的解毒代謝作用[23]。

昆蟲的GSTs基因在不同發(fā)育階段的表達水平存在一定的差異，說明其在生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，3個GSTs基因在煙草甲各發(fā)育階段均有表達，且低齡幼蟲期的表達量顯著高于高齡幼蟲、蛹期和成蟲期，這可能與它們在低齡幼蟲期發(fā)揮著重要作用有關。進一步分析發(fā)現(xiàn)，低齡幼蟲剛由卵孵化形成，需要大量取食以滿足器官發(fā)育，這一時期外源化合物的攝取和代謝產(chǎn)生的物質隨之增多，因此相關的解毒代謝酶如GSTs的mRNA表達量相應升高。橘小實蠅的5個GSTs基因（BdGSTe4、BdGSTe2、BdGSTd5、BdGSTd6和BdGSTo1）在幼蟲期的表達量明顯高于成蟲期[8]，此類現(xiàn)象同岡比亞按蚊[20]、小菜蛾（Plutella xylostella）[27]、斜紋夜蛾[23]等昆蟲的研究結果相一致。不同物種體內的GSTs在各發(fā)育階段的表達量變化不盡相同：如柑橘全爪螨6個GSTs基因在卵期表達量較高，推測其可能與卵發(fā)育過程中激素調節(jié)相關[28]；QIN等[24]應用半定量RT-PCR分析了10個GSTs基因在飛蝗卵、一齡幼蟲至成蟲期的表達情況，發(fā)現(xiàn)LmGSTd1、LmGSTs1、LmGSTs3、LmGSTs5和LmGSTt3在各發(fā)育階段的表達量沒有明顯的變化，說明這些酶屬于組成型表達酶，在飛蝗整個生命過程中均起作用。

氣調技術被廣泛應用于倉儲害蟲的管理中，它主要利用高濃度CO2和低濃度O2的協(xié)同作用來提高控制害蟲的效果[14,29]。CO2主要通過觸殺途徑起效，使昆蟲神經(jīng)過度興奮，刺激昆蟲氣門開放，改變通風速率，導致蟲體水分喪失而出現(xiàn)死亡[30]。不僅如此，CO2氣調還可以引起昆蟲體內解毒代謝酶系和靶標酶的變化，并導致其體內能源物質不斷被消耗[11,15-16]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CO2氣調處理煙草甲成蟲6 h后，GST酶活性顯著高于對照，說明GSTs在煙草甲應對CO2氣調脅迫過程中發(fā)揮著關鍵作用[17]。本研究以GSTs基因高表達的低齡幼蟲為研究對象，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CO2氣調處理6 h后，LsGSTt1和LsGSTs1表達量顯著高于對照組，而LsGSTd1表達量相對于對照無顯著差異，我們推測CO2氣調脅迫所引起的損傷修復需要多個GSTs基因參與，通過轉錄和翻譯合成多種GST同工酶以共同應對外源脅迫。多種GSTs基因的過量表達可能是煙草甲應對CO2氣調脅迫耐受性形成的重要因素。

本研究根據(jù)煙草甲轉錄組信息，成功克隆了LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1基因的cDNA全長序列，這3個基因在煙草甲各發(fā)育時期均有表達，且在低齡幼蟲期的表達量最為活躍。經(jīng)CO2氣調脅迫后，LsGSTt1和LsGSTs1表現(xiàn)出了明顯的應激表達反應。下一步將研究煙草甲體內其他GSTs基因在氣調脅迫過程中的作用，為系統(tǒng)闡明煙草甲GSTs基因家族對氣調脅迫應答的分子機制奠定基礎。

[1] SHEEHAN D,MEADE G,FOLEY V M,et al.Structure,function and evolution ofglutathione transferases:Implicationsfor classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily.Biochemical Journal,2001,360(1):1-16.

[2] LI X C,SCHULER M A,BERENBAUM M R.Molecular mechanism of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics.Annual Review of Entomology,2007,52:231-253.

[3] PARKES T L,HILLIKER A J,PHILIPS J P.Genetic and biochemical analysis of glutathione-S-transferases in the oxygen defense system of Drosophila melanogaster.Genome,1993,36(6):1007-1014.

[4] AGIANIAN B,TUCKER P A,SCHOUTEN A,et al.Structure of a Drosophila sigma class glutathione S-transferase reveals a novel active site topography suited for lipid peroxidation products.Journal of Molecular Biology,2003,326(1):151-165.

[5] ROGERS M E,JANI M K,VOGT R G.An olfactory-specific glutathione-S-transferase in the sphinx moth Manduca sexta.Journal of Experimental Biology,1999,202(12):1625-1637.

[6] YU Q Y,LU C,LI B,et al.Identification,genomic organization and expression pattern of glutathione S-transferase in the silkworm,Bombyx mori.Insect Biochemistry and Molecular Biology,2008,38(12):1158-1164.

[7] QIN G H,JIA M,LIU T,et al.Characterization and functional analysis of four glutathione S-transferases from the migratory locust,Locusta migratoria.PLoS One,2013,8(3):e58410.

[8] HU F,DOU W,WANG J J,et al.Multiple glutathione S-transferase genes:Identification and expression in oriental fruit fly,Bactrocera dorsalis.Pest Management Science,2014,70(2):295-303.

[9] GULLIPALLI D,ARIF A,APAROY P,et al.Identification of a developmentally and hormonally regulated delta-class glutathione S-transferase in rice moth Corcyra cephalonica.Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2010,156(1):33-39.

[10]ZHANG Y Y,GUO X L,LIU Y L,et al.Functional and mutational analyses of an omega-class glutathione S-transferase(GSTO2)that is required for reducing oxidative damage in Apis cerana cerana.Insect Molecular Biology,2016,25(4):470-486.

[11]LI C,LI Z Z,CAO Y,et al.Partial characterization of stressinduced carboxylesterase from adults of Stegobium paniceum and Lasioderma serricorne(Coleoptera:Anobiidae)subjected to CO2-enriched atmosphere.Journal of Pest Science,2009,82(1):7-11.

[12]OMAE Y,FUCHIKAWA T,NAKAYAMA S,et al.Life history and mating behavior of a black-bodied strain of the cigarette beetle Lasioderma serricorne(Coleoptera:Anobiidae).Applied Entomology and Zoology,2012,47(2):157-163.

[13]PIMENTEL M A G，F(xiàn)ARONI L R D,TóTOLA M R,et al.Phosphine resistance,respiration rate and witness consequences in stored-product insects.Pest Management Science,2007,63(9):876-881．

[14]GUNASEKARAN N,RAJENDRAN S.Toxicity of carbon dioxide to drugstore beetle Stegobium paniceum and cigarette beetle Lasioderma serricorne.Journal of Stored Products Research,2005,41(3):283-294.

[15]李燦,李子忠,周波,等.高濃度二氧化碳對藥材甲和煙草甲乙酰膽堿酯酶活性的影響.植物保護學報,2007,34(6):642-646.LI C,LI Z Z,ZHOU B,et al.Effect of carbon dioxide enriched atmosphere on the activity of acetylcholinesterase in adults of Stegobium paniceum and Lasioderma serricorne.Journal of Plant Protection,2007,34(6):642-646.(in Chinese with English abstract)

[16]曹宇,楊文佳,孟永祿,等.CO2氣調對煙草甲的毒理作用及其能源物質的含量和利用率.西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版),2015,43(11):123-128.CAO Y,YANG W J,MENG Y L,et al.Toxicity of CO2to Lasioderma serricorne and content and utilization of its energy substances.Journal of Northwest A&F University(Natural Science Edition),2015,43(11):123-128.(in Chinese with English abstract)

[17]李燦,李子忠.氣調脅迫下3種中藥材儲藏期害蟲谷胱甘肽轉移酶活性研究.植物保護,2009,35(2):91-94.LI C,LI Z Z.GSTs activity of three pests in stored Chinese medicinal materials.Plant Protection,2009,35(2):91-94.(in Chinese with English abstract)

[18]TAMURA K,PETERSON D,PETERSON N,et al.MEGA5:Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods.Molecular Biology and Evolution,2011,28(10):2731-2739.

[19]LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the2－ΔΔCTmethod.Methods,2001,25(4):402-408.

[20]DING Y C,ORTELLI F,ROSSITER L C,et al.The Anopheles gambiae glutathione transferase supergene family:Annotation,phylogeny and expression profiles.BMC Genomics,2003,4:35.

[21]TU C P D,AKGüL B.Drosophila glutathione S-transferases.Methods in Enzymology,2005,401:204-226.

[22]SHI H X,PEI L H,GU S S,et al.Glutathione S-transferase(GST)genes in the red flour beetle,Tribolium castaneum,and comparative analysis with five additional insects.Genomics,2012,100(5):327-335.

[23]HUANG Y F,XU Z B,LIN X Y,et al.Structure and expression of glutathione S-transferase genes from the midgut of the common cutworm,Spodoptera litura(Noctuidae)and their response to xenobiotic compounds and bacteria.Journal of Insect Physiology,2011,57(7):1033-1044.

[24]QIN G H,JIA M,LIU T,et al.Identification and characterisation of ten glutathione S-transferase genes from oriental migratory locust,Locusta migratoria manilensis(Meyen).Pest Management Science,2011,67(6):697-704.

[25]LI X W,ZHANG X,ZHANG J Z,et al.Identification and characterization of eleven glutathione S-transferase genes from the aquatic midge Chironomus tentans(Diptera:Chironomidae).Insect Biochemistry and Molecular Biology,2009,39(10):745-754.

[26]LOW W Y,FEIL S C,NG H L,et al.Recognition and detoxification of the insecticide DDT by Drosophila melanogaster glutathione S-transferase D1.Journal of Molecular Biology,2010,399(3):358-366.

[27]CHEN X E,ZHANG Y L.Identification and characterization of multiple glutathione S-transferase genes from the diamondback moth,Plutella xylostella.Pest Management Science,2015,71(4):592-600.

[28]LIAO C Y,ZHANG K,NIU J Z,et al.Identification and characterization of seven glutathione S-transferase genes from citrus red mite,Panonychus citri(McGregor).International Journal of Molecular Sciences,2013,14(12):24255-24270.

[29]WONG-CORRAL F J,CASTANé C,RIUDAVETS J.Lethal effects of CO2-modified atmospheres for the control of three Bruchidae species.Journal of Stored Products Research,2013,55:62-67.

[30]MITCHAM E J,MARTIN T A,ZHOU S.The mode of action of insecticidal controlled atmospheres.Bulletin of Entomological Research,2006,96(3):213-222.

Expression analysis of glutathione S-transferase genes in Lasioderma serricorne(Coleoptera:Anobiidae)subjected to CO2-enriched atmosphere.Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(5):599-607

XU Kangkang1,DING Tianbo2,YAN Yi1,LI Can1,YANG Wenjia1*
(1.College of Biology and Engineering of Environment,Guiyang University/Guizhou Provincial Key Laboratory for Rare Animal and Econimic Insects of the Mountainous Region,Guiyang 550005,China;2.College of Plant Health and Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,Shandong,China)

glutathione S-transferase;Lasioderma serricorne;gene cloning;expression pattern

S 435.72；Q 965

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2017.02.261

Summary The cigarette beetle,Lasioderma serricorne(Fabricius)(Coleoptera:Anobiidae),is a destructive stored pest distributed worldwide.Females typically oviposit in the stored materials,and the developing larvae tunnel through the stored food products on which they feed,resulting in tremendous damages to stored grains and seeds,tobacco,pet food,and dried flowers.Currently,excessive use of fumigation with insecticides has developed resistance to commonly insecticides in this insect,leading to environmental risk and its resurgence.

Controlled atmosphere(CA)treatments using low oxygen(O2)and high carbon dioxide(CO2)have been used commercially to control stored pests.The application of CA is a safe alternative way to chemical pesticides,and has been used to control the cigarette beetles.Our earlier studies showed that L.serricorne displayed a great capacity to withstandCO2stress.The activities of glutathione S-transferases(GSTs)in L.serricorne were significantly increased after exposed to CO2enriched atmosphere,implying that GSTs might be critical for tolerating to CO2stress.However,little is known about the molecular mechanism of GSTs in response to CO2exposure in L.serricorne.

國家自然科學基金（31460476）；貴州省科學技術基金聯(lián)合基金（黔科合LH字〔2014〕7167）；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)（黔科合人才〔2016〕4020）；貴陽學院高層次人才科研啟動費（校人才2014003）。

楊文佳（http://orcid.org/0000-0003-4339-2158）,E-mail:yangwenjia10@126.com

（First author）：許抗抗（http://orcid.org/0000-0002-4203-911X）,E-mail:kkxu1988@163.com

2017-02-26；接受日期（Accepted）:2017-06-20

In this study,three full-length cDNAs of GSTs in L.serricorne were cloned by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).The deduced amino acid sequence analysis of the three genes was performed by bioinformatics methods.Quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to establish expression profiles for those genes from different developmental stages and in response to CO2exposure.

According to the predicted GST sequences from the transcriptome datesets of L.serricorne,the full-length cDNAs of three novel genes were obtained and named LsGSTt1,LsGSTd1 and LsGSTs1(GenBank accession numbers:KY549655,KY549656,KY549657),respectively.The LsGSTt1 cDNA contained an open reading frame(ORF)of 564 nucleotides,encoding a polypeptide of 187 amino acids with an estimated molecular mass of 22.4 kDa and an isoelectric point(pI)of 8.54.The LsGSTd1 cDNA contained an ORF of 651 nucleotides,encoding a polypeptide of 216 amino acids with an estimated molecular mass of 24.5 kDa and a pI of 5.95.The LsGSTs1 cDNA contained an ORF of 696 nucleotides,encoding a polypeptide of 231 amino acids with an estimated molecular mass of 26.2 kDa and a pI of 5.06.Homology analysis indicated that the predicted amino acid sequences of the three genes had typical features of GSTs,including an N-terminal domain and a C-terminal domain.Phylogenetic analysis revealed that the three genes belonged to three different cytosolic classes,including Theta(LsGSTt1),Delta(LsGSTd1)and Sigma(LsGSTs1).Temporal expression profile revealed that all the three GSTs genes were constitutively expressed in the testing stages,exhibited similar developmental expression patterns,with the highest expression level measured in the early larval stage.Compared with the control,the mRNA levels of LsGSTd1 did not change significantly following exposure to CO2stress.However,when exposed to 50%lethal concentration(LC50)of CO2,the expression levels of LsGSTt1 and LsGSTs1 were significantly increased.

In conclusion,the results suggest that LsGSTt1 and LsGSTs1 in L.serricorne might play important roles in defense responses challenged by CO2stress.This study provides the basis for clarifying the response mechanism of insects to CO2stress.