劉艷 羅敏 秦民堅(jiān) 謝國勇 章文偉 陳強(qiáng) 肖波 李娜

摘要：目的 研究多花黃精的生殖生物學(xué)特性。方法 在花期定點(diǎn)定株觀察記錄多花黃精的開花習(xí)性，用TTC法檢測其開花各時(shí)期的花粉活力，采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測不同開花時(shí)期柱頭的可授性，估算雜交指數(shù)并計(jì)算其花粉胚珠比，通過6種不同的人工授粉方式處理確定多花黃精的繁育系統(tǒng)類型。結(jié)果 多花黃精在4月5日左右現(xiàn)蕾，4月10日左右開花，5月上旬陸續(xù)開始結(jié)實(shí)，花期約30～40 d。自花藥未開裂時(shí)花粉即開始具有活力，花朵枯萎后花粉失去活力，開花當(dāng)日花粉活力達(dá)73.06%±5.19%。自花朵未開放時(shí)柱頭即具有活性，花朵開始衰敗時(shí)柱頭活性減弱消失。多花黃精的雜交指數(shù)為4，據(jù)Dafni標(biāo)準(zhǔn)其繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交，需要傳粉者；其花粉胚珠比為1799.20±445.54，據(jù)Cruden標(biāo)準(zhǔn)其繁育系統(tǒng)為兼性異交。人工控制授粉試驗(yàn)結(jié)果表明多花黃精具有無融合生殖、自交和異交3種生殖方式，其結(jié)實(shí)率受外界條件影響較大，總體結(jié)實(shí)率較低，自然狀態(tài)下僅為17.46%。結(jié)論 多花黃精具有無融合生殖、有性生殖與無性生殖3種生殖方式。

關(guān)鍵詞：多花黃精；開花習(xí)性；花粉活力；柱頭活性；繁育系統(tǒng)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.017

中圖分類號(hào)：R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）11-0071-04

Study on Reproductive Biology of Polygonatum cyrtonema Hua LIU Yan1， LUO Min1， QIN Min-jian2， XIE Guo-yong2， ZHANG Wen-wei1， CHEN Qiang1， XIAO Bo1， LI Na1 （1. Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation， Chongqing Branch Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Chongqing 408435， China； 2. China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）

Abstract： Objective To study the reproductive biology of Chinese herbal medicine Polygonatum cyrtonema Hua. Methods The flowering habit of P. cyrtonema was observed and recorded regularly. The pollen viability at different flowering periods was detected by TTC. The stigma activity at different flowering periods was measured by the benzidine-hydrogen peroxide method. The hybridization index was estimated and pollen-ovule ratio was calculated. The breeding system of P. cyrtonema was determined by six different artificial pollination treatments. Results The flower buds of P. cyrtonema appeared at April 5. They bloomed at April 10 and fruited early in May， flowering about 30–40 days. The pollen began to have viability since the anthers were not cracked， and loss viability after flowers withered. The pollen viability at the bloom day was about 73.06%±5.19%. The stigmas began to have activity before flowers opening and lost it when the flowers began to decline. The hybridization index was 4， so the breeding system of P. cyrtonema Hua was partly self-compatible and xenogamy needing pollinator according to Dafnis standard. The pollen-ovule ratio was 1799.20±445.54， therefore the breeding system of P. cyrtonema Hua was facultative xenogamy according to Crudens standard. The results of artificial pollination experiments showed that P. cyrtonema Hua had three breeding methods， including apomixis， selfing and outcrossing. The fruit setting rate of P. cyrtonema Hua was greatly influenced by external conditions such as strong wind and rain. Generally， P. cyrtonema Hua had a low fruit-set percentage because of obvious flower and fruit dropping. The natural fruit setting rate was only 17.46%. Conclusion The coexistence of apomixes， sexual and asexual reproduction in P. cyrtonema are the survival strategy adapting to different habitat types.

Key words： Polygonatum cyrtonema Hua； flowering habit； pollen viability； stigma activity； breeding system

基金項(xiàng)目：重慶市衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（zy201402124、zy201702147）；西部之光訪問學(xué)者計(jì)劃項(xiàng)目（2016年）

通訊作者：章文偉，E-mail：ssf333@126.com

多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua隸屬于百合科Liliaceae黃精屬Polygonatum，為《中華人民共和國藥典》收載黃精的原植物之一。屬藥食同源植物，為我國傳統(tǒng)大宗中藥材。其性平，味甘，入脾、肺、腎經(jīng)。功效養(yǎng)陰潤肺、補(bǔ)脾益氣、滋腎填精，主治陰虛勞嗽、肺燥咳嗽、脾虛乏力、食少口干、內(nèi)熱消渴、腎虧腰膝酸軟、陽痿遺精、耳鳴目暗、須發(fā)早白、體虛羸瘦、風(fēng)癩癬疾。多花黃精為多年生草本植物，生于山林、灌叢、溝谷旁的陰濕肥沃土壤中，分布于我國中南地區(qū)及江蘇、安徽、浙江、江西、福建、四川、重慶、貴州等地。

目前對多花黃精的研究包括對其生理生態(tài)學(xué)方面的研究[1-2]、種植技術(shù)研究[3-7]、種子繁殖技術(shù)研究[8]、分子生物學(xué)研究[9]、組培快繁方面的研究[10]等。目前對多花黃精生殖生物學(xué)特性以及繁育系統(tǒng)方面的研究報(bào)道非常少，田啟建等[11-12]研究了栽培多花黃精的物候期及開花結(jié)實(shí)特性，發(fā)現(xiàn)多花黃精蕾期為45 d左右，花期約20 d，結(jié)實(shí)率為58.37%，落果嚴(yán)重，田間成熟果實(shí)量非常小。

多花黃精種子成熟率低，目前在藥材生產(chǎn)中多花黃精的栽培主要以無性繁殖為主（依靠地下莖）[2，11]，但是長期的無性繁殖弊端比較大，如品種退化、病蟲害發(fā)生嚴(yán)重等，使藥材產(chǎn)量和質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。本研究著重對多花黃精的花粉活力、柱頭活性及繁育系統(tǒng)等進(jìn)行檢測，研究其有性生殖特性及繁育系統(tǒng)特征，為多花黃精在規(guī)范化栽培中能盡快解決無性繁殖的弊端、提高有性繁殖的比率提供依據(jù)，并為多花黃精后續(xù)的種質(zhì)資源開發(fā)提供繁育系統(tǒng)方面的技術(shù)參考。

1 材料

試驗(yàn)地位于重慶市南川區(qū)三泉鎮(zhèn)石門溝，為重慶市藥物種植研究所的黃精種質(zhì)資源圃，栽植面積為360 m2。所用的多花黃精栽種2年，以根莖為繁殖材料，種莖來自湖南省新化縣，開花時(shí)經(jīng)重慶市藥物種植研究所植物分類學(xué)專家劉正宇研究員鑒定為多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua。于2015年4-5月和2016年4-5月進(jìn)行開花、結(jié)實(shí)物候觀察及人工控制授粉試驗(yàn)等。

2 方法與結(jié)果

2.1 開花習(xí)性觀察

從2015年4月1日開始，每3 d觀察1次現(xiàn)蕾情況，現(xiàn)蕾之后，隨機(jī)選取5株進(jìn)行標(biāo)記，觀察記錄其開花順序、初花、盛花、末花及結(jié)實(shí)時(shí)間等。同時(shí)對即將開放的6朵花蕾掛牌，定位觀察并記錄花朵個(gè)體水平的開花進(jìn)程。

多花黃精的花蕾與花均按從下往上的順序生出和開放，花期為4月上旬至5月下旬。2015年4月5日左右開始現(xiàn)蕾，4月10日左右開始開花，單花花期2～2.5 d?；ǘ溆谕砩?～10點(diǎn)開始張開，至次日早8點(diǎn)完全張開，持續(xù)24 h后開始凋謝，花朵凋謝時(shí)花瓣先閉合，1 d后整朵花枯萎。盛花期為4月底至5月初，持續(xù)約7～10 d。5月上旬陸續(xù)開始結(jié)實(shí)，有明顯的落花落果現(xiàn)象，結(jié)實(shí)率不高。

2.2 花粉活力及柱頭可授性檢測

于盛花期隨機(jī)采集多花黃精開花前后不同大小的新鮮花朵，將少量花粉置于載玻片上，滴1～2滴0.5%TTC溶液，充分混勻后蓋上蓋玻片，置于35 ℃恒溫箱中15 min，之后在顯微鏡下觀察。選取5個(gè)視野，每個(gè)視野花粉數(shù)約為70～100粒，凡被染成紅色的花粉為具有活力的花粉，淡紅色或無色者為不具有生活力的花粉?；ǚ刍盍Γ?）=紅色花粉數(shù)÷花粉總數(shù)×100%。結(jié)果見表1。

采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測不同開花時(shí)期柱頭的可授性。隨機(jī)選取開花前至開花后不同生長時(shí)期的花朵，在凹面載玻片中加入體積比為1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22的反應(yīng)液，將柱頭浸入其中，觀察柱頭是否呈現(xiàn)藍(lán)色并產(chǎn)生大量氣泡。結(jié)果見表1。

檢測結(jié)果顯示，多花黃精自花藥未開裂時(shí)花粉即開始具有活力，經(jīng)TTC染色后花粉粒呈現(xiàn)紅色，花朵枯萎后，花粉失去活力。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果（見表1），花長0.6 cm以下的花粉不具有活力，花長0.8 cm以上開始具有活力，且隨著花朵的逐漸成熟花粉活力逐漸增強(qiáng)，至開花當(dāng)天花粉活力最高，為73.06%±5.19%，而開花次日至花朵凋謝，花粉活力逐漸下降，開花第2日花粉活力已下降至41.89%±5.10%，遠(yuǎn)不及開花當(dāng)日的花粉活力。

多花黃精自花朵未開放時(shí)柱頭即具有活性，一直延續(xù)至開花時(shí)，當(dāng)花朵開始衰敗時(shí)，柱頭活性減弱消失。根據(jù)聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測結(jié)果（見表1），花長1.3 cm以下的柱頭沒有可授性，花長1.4 cm以上的柱頭才具有可授性，柱頭浸入液體中呈現(xiàn)藍(lán)色，柱頭周圍產(chǎn)生大量氣泡。直至開花第3日花朵開始凋謝，柱頭活性消失，不再具有可授性。

2.3 雜交指數(shù)的估算

按照Dafni的標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行花朵直徑、花朵大小及開花行為的測定及繁育系統(tǒng)的評(píng)判。①花朵或花序直徑：<1 mm記為0，1～2 mm記為1，>2～6 mm記為2，>6 mm記為3。②花藥開裂時(shí)間與柱頭可授期之間的時(shí)間間隔：同時(shí)或雌蕊先熟記為0；雄蕊先熟記為1。③柱頭與花藥的空間位置：同一高度記為0；空間分離記為1。以上三者之和為雜交指數(shù)（outcrossing index，OCI）。OCI=0時(shí)，繁育系統(tǒng)為閉花受精；OCI=1時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性自交；OCI=2時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交；OCI=3時(shí)，繁育系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者；OCI=4時(shí)，繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交，需要傳粉者。

多花黃精的花朵直徑<6 mm，測量值記為2；雄蕊先熟，花粉在柱頭具有可授性之前已經(jīng)具有活力，測量值記為1；開花時(shí)柱頭與花藥在空間位置上是分離的，柱頭位置比花藥高約1 mm，測量值記為1。因此，多花黃精的OCI值為4，其繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交，需要傳粉者。

2.4 花粉胚珠比

隨機(jī)選取5朵花藥未開裂的花。將1朵花中所有的花藥置于離心管中，加200 ?L染液，將花藥搗碎使花粉散出成為懸濁液，在渦旋儀上震蕩60 s，然后用移液槍取5份1 ?L的樣本于載玻片上，于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，取平均值。1朵花中總的花粉數(shù)=1 ?L染液中的花粉數(shù)×200。將1朵花的子房在解剖鏡下仔細(xì)剖開，計(jì)數(shù)胚珠數(shù)。花粉胚珠比（P/O）=花粉數(shù)÷胚珠數(shù)。根據(jù)Cruden的標(biāo)準(zhǔn)[14]進(jìn)行繁育系統(tǒng)的判斷：P/O為2.7～5.4，繁育系統(tǒng)為閉花受精；P/O為18.1～39.0，為專性自交；P/O為31.9～396，為兼性自交；P/O為244.7～2588，為兼性異交；P/O為2108～195 525，為專性異交。

結(jié)果多花黃精P/O為1799.20±445.54。依據(jù)Cruden的標(biāo)準(zhǔn)可以判斷，多花黃精的繁育系統(tǒng)為兼性異交。

2.5 繁育系統(tǒng)檢測

于盛花期隨機(jī)選取花朵，分6個(gè)處理進(jìn)行人工控制授粉試驗(yàn)。①不去雄，不套袋：檢測自然狀態(tài)下授粉情況。②去雄，套袋，不授粉：檢測是否具有無融合生殖。③不去雄，套袋：檢測是否具有自發(fā)的自花授粉。④人工自花授粉：檢測自花自交情況。⑤人工同株異花授粉：檢測同株異花自交情況。⑥人工異株異花授粉：檢測異交情況。

開花前進(jìn)行去雄操作并用6 cm×8 cm硫酸紙袋將單花套住，開花時(shí)完成人工控制授粉試驗(yàn)后繼續(xù)將單花套住，套袋及授粉用的花朵均選取完整沒有開裂的花藥。自然對照采用315朵花，其余每處理幾十朵花不等。3周后統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率，子房膨大者視為結(jié)實(shí)。結(jié)實(shí)率（%）=果實(shí)數(shù)÷花數(shù)×100%。結(jié)果見表2。

人工控制授粉試驗(yàn)結(jié)果顯示：去雄、套袋的多花黃精可以結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)率為20.00%，說明其存在無融合生殖現(xiàn)象；不去雄、套袋的多花黃精結(jié)實(shí)率為20.83%，與去雄、套袋的結(jié)實(shí)率無明顯差異，說明缺少傳粉媒介輔助時(shí)自花花粉對結(jié)實(shí)率的貢獻(xiàn)較?。蝗斯ぷ曰ㄊ诜?、同株異花授粉和異株異花授粉的結(jié)實(shí)率分別為21.43%、21.05%和23.53%，均略高于去雄、套袋的結(jié)實(shí)率，說明經(jīng)過傳粉媒介的作用，自花、同株異花、異株異花的花粉均能相應(yīng)提高結(jié)實(shí)率。多花黃精具有無融合生殖、自交和異交3種繁殖方式。多花黃精自然授粉狀態(tài)下的結(jié)實(shí)率為17.46%，其結(jié)實(shí)率受外界條件影響較大，大風(fēng)大雨都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的落花落果，因此總體而言多花黃精的結(jié)實(shí)率比較低。

3 討論

多花黃精的花期約為2個(gè)月，單花能開2～2.5 d，盛花期持續(xù)約7～10 d，這與田啟建等[11-12]對栽培多花黃精的物候期研究結(jié)果基本吻合。多花黃精在花長0.8 cm以上時(shí)花粉即開始具有活力，開花當(dāng)日花粉活力達(dá)到73.06%±5.19%，一直延續(xù)至花朵枯萎后，花粉失去活力。花長1.5 cm以上的柱頭具有可授性，當(dāng)花朵開始衰敗時(shí)，柱頭活性減弱消失。多花黃精的結(jié)實(shí)率受外界條件影響較大，大風(fēng)大雨都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的落花落果，本研究6種人工控制授粉試驗(yàn)中多花黃精的結(jié)實(shí)率均比較低，約為20%，這與田啟建等[11-12]研究得出的“落果嚴(yán)重，田間成熟果實(shí)量非常小”的結(jié)論一致。本研究中的結(jié)實(shí)率比該研究發(fā)現(xiàn)的多花黃精結(jié)實(shí)率58.37%要低得多，其原因可以歸結(jié)為以下幾點(diǎn)：①試驗(yàn)地位于重慶市南川區(qū)三泉鎮(zhèn)，常年風(fēng)力在2級(jí)以上，經(jīng)常有持續(xù)強(qiáng)風(fēng)，大風(fēng)加強(qiáng)了落花落果。②試驗(yàn)地的土壤相對干燥，土壤肥力不高。③栽培年限對多花黃精植株的開花數(shù)和結(jié)實(shí)率具有顯著影響[11]，試驗(yàn)用多花黃精利用塊莖栽種了2～3年，屬于低齡，因此造成結(jié)實(shí)率相對偏低。

多花黃精的雜交指數(shù)為4，根據(jù)Dafni的判定標(biāo)準(zhǔn)其繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交，需要傳粉者。其花粉胚珠比為1799.20±445.54，據(jù)Cruden的標(biāo)準(zhǔn)其繁育系統(tǒng)為兼性異交。這2種方法檢測到的繁育系統(tǒng)結(jié)果基本一致，也與人工控制授粉試驗(yàn)的結(jié)果相吻合，多花黃精具有無融合生殖現(xiàn)象，并且經(jīng)過傳粉媒介的作用，也能進(jìn)行自交和異交。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，多花黃精的傳粉昆蟲主要為蜂類，有熊蜂Bombus sp.和淡脈隧蜂Lasioglossum sp.等。加之目前應(yīng)用最多的地下莖繁殖，多花黃精既存在有性繁殖也存在無性繁殖。有性繁殖與無性繁殖的權(quán)衡與生境關(guān)系密切，在對典型植物珠芽蓼的研究中發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境惡劣的生境中珠芽蓼減少了投資到營養(yǎng)生長的資源并增加了對繁殖器官的投資，而且對花的資源投資優(yōu)先于對珠芽的資源投資，表明高山植物在適應(yīng)極端環(huán)境過程中有性繁殖比無性繁殖具有更為重要的作用[15]。無融合生殖是對不良環(huán)境的短暫適應(yīng)，是有性生殖受阻的一種生殖補(bǔ)償，由于沒有外來基因?qū)?，缺乏遺傳多樣性，在長期的自然選擇中會(huì)逐漸被淘汰[16]。多花黃精的多種繁殖方式并存，有利于其適應(yīng)不同的生境類型從而存活下來，確保其種群的繁衍。

多花黃精種子的成熟率低，同時(shí)由于其存在較嚴(yán)重的休眠現(xiàn)象，需要2～3年才能出苗，所以目前多花黃精的栽培主要以無性繁殖為主，但長期無性繁殖所導(dǎo)致的品種退化、病蟲害嚴(yán)重等問題使藥材產(chǎn)量和質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。想破除這些弊端，唯有在實(shí)際栽培中加強(qiáng)多花黃精的有性繁殖方式，除了自然的昆蟲授粉外，輔助以人工授粉，提高其結(jié)實(shí)率。同時(shí)在實(shí)際生產(chǎn)中，針對落花落果問題要加強(qiáng)防護(hù)措施，如增加防護(hù)網(wǎng)、套種高大農(nóng)作物等，減少自然環(huán)境條件導(dǎo)致的落花落果。本研究為多花黃精的規(guī)范化栽培生產(chǎn)及優(yōu)良種質(zhì)資源的篩選提供了依據(jù)和技術(shù)參考，今后將重點(diǎn)關(guān)注多花黃精優(yōu)良品種的選育及如何打破其種子休眠，加快種子萌發(fā)并提高發(fā)芽率，為中藥材市場提供品種優(yōu)良的高質(zhì)量種子。

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