鄧鴻英+謝淑華+衛(wèi)晉波

摘 要：簡介比濁法和活菌計數(shù)法測定菌液濃度的操作步驟和優(yōu)缺點，將比濁法與活菌計數(shù)法相結合，測定了常見模式菌株比濁度對應的活菌計數(shù)濃度，為菌種濃度的預估提供一個快速，準確，便捷的方法。

關鍵詞：菌液濃度；活菌計數(shù)；比濁度

在微生物檢驗工作中，比如藥品微生物限度檢查方法驗證、防腐效力測試、消毒液消毒效果驗證、培養(yǎng)基適用性檢查等等，常常需要加入一定濃度的菌懸液，菌液濃度過高或過低都將影響測試結果的準確性，因此控制菌液濃度是必要且關鍵的一步。測定菌液濃度的方法一般有三種，其一為活菌計數(shù)法，此法能準確判斷菌液濃度，是目前國內的仲裁法，但是該法需要培養(yǎng)后計數(shù)，有明顯的滯后性；其二為顯微鏡觀察法，該方法適用于菌體較大的菌種濃度的測定，如霉菌和酵母菌，具有方便快捷的優(yōu)點，但不適用于菌體細小的菌種濃度的測定，有較大的局限性；三為比濁法，此法能快速地判斷菌液濃度，但結果為粗略的估計值，不同大小的菌種其形成的光密度不同，因此同一個比濁度，不同的菌結果差異較大，準確性不高。

本文具體介紹將比濁法和活菌計數(shù)法相結合的測定方法，測定了常見模式菌株1麥氏比濁度（MCFARLAND）的菌液濃度，用于指導日常微生物檢測工作中菌液濃度的快速、準確測定，具有較強的實用價值。

一、菌種及菌液的制備

1.菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）

大腸埃希菌（Escherichia coli ATCC 8739）

枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilisATCC 6633）

乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphiCMCC（B）50094）

白色念珠菌（Candida albicans ATCC 10231）

黑曲霉（Aspergillusniger ATCC 16404）

以上菌種從廣東省微生物菌種保藏中心采購，經復蘇兩代至五代內使用。

2.菌液的制備

（1）將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌的凍干管封口端（即遠離凍干粉的一端）在火焰上分別灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內用滅菌鑷子輕輕掰開裂口，分別用0.5mL TSB溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株全部轉移到10mL TSB中，置36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時，此為第一代菌種。在生物安全柜內分別用無菌接種環(huán)挑取1接種環(huán)第一代上述菌懸液分別劃線接種于TSA中然后置于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時，此為第二代菌種，備用。

（2）將白色念珠菌凍干管封口端在火焰上灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內用滅菌鑷子輕輕掰開裂口，用0.5mL改良馬丁液體培養(yǎng)基溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株全部轉移到10mL 改良馬丁液體培養(yǎng)基中，置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時，此為第一代菌種。在生物安全柜內無菌接種環(huán)挑取1接種環(huán)第一代菌懸液劃線接種于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中。將新鮮接種的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時，此為第二代菌種，備用。

（3）將黑曲霉凍干管封口端在火焰上灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內用滅菌鑷子輕輕掰開裂口，用0.5mL含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株劃線接種到改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，此為第一代菌種。在生物安全柜內，用無菌接種環(huán)挑取1接種環(huán)第一代黑曲霉劃線接種于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中。然后置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，此為第二代菌種。向第二代黑曲霉菌種管內加入5ml含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液，用無菌接種環(huán)將孢子洗脫，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）至無菌試管內，備用。

二、培養(yǎng)基和儀器

1.培養(yǎng)基

（1）商品培養(yǎng)基。

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）瓶裝顆粒培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）

改良馬丁液體培養(yǎng)基

改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

0.5%無菌T.T.C

以上培養(yǎng)基從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司采購商品培養(yǎng)基，按產品說明書配制，滅菌后備用，其中TSA在使用前每100mL培養(yǎng)基加入1mL0.5%無菌T.T.C以便于細菌菌落的觀察。

（2）按配方配制的培養(yǎng)基。

0.85%氯化鈉

0.9%氯化鈉

含0.05%吐溫80的0.9%氯化鈉

以上培養(yǎng)基按配方配制，滅菌后備用。

2.儀器

生物安全柜（型號：SBSC1600ⅡB2）

恒溫培養(yǎng)箱（36±1℃，28±2℃）

麥氏比濁儀（產品貨號：wi114629，生產商：梅里埃）

漩渦混合器（型號：QA-1）

三、菌種比濁度的測定及調節(jié)

1.按儀器使用說明書操作，用標準麥氏比濁管檢定儀器，當不同濃度的麥氏比濁管讀數(shù)與標準麥氏比濁管標定的值在誤差允許范圍內時，方可進行下一步驟。

2.用0.85%無菌氯化鈉作為空白，調零。

3.分別用無菌接種環(huán)挑取1.2.1和1.2.2的平板上菌落適量，分別在裝有5mL 0.85%氯化鈉的50mL錐形瓶瓶壁上將菌分散（蘸取少量氯化鈉后在瓶壁上來回劃線，以便將菌分散后使之易于混勻），然后用漩渦混合器將菌液混勻備用。endprint

4.測定菌液比濁度，用相應菌種的菌落或氯化鈉調節(jié)菌液的濃度，使菌液比濁度讀數(shù)約為1MCFARLAND。

四、活菌計數(shù)法計數(shù)各菌種1 MCFARLAND的菌含量

1.金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌在生物安全柜內進行操作。用0.85%無菌氯化鈉作為稀釋劑，10倍梯度逐級稀釋至10-7，分別依次測定每種菌10-5～10-7三個稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)。用移液槍及滅菌移液槍頭各吸取1mL注入滅菌平皿中，每種菌每個梯度制備2個平行。注入約20mL，45℃～50℃的TSA培養(yǎng)基，隨即轉動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，翻轉平皿，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48h，然后進行菌落計數(shù)。先用肉眼觀察，必要時可用放大鏡，點計菌落數(shù)，記下各平皿的菌落數(shù)后，求出每種菌的平均菌落數(shù)，換算成每種菌1 MCFARLAND的菌含量。

2.白色念珠菌和黑曲霉在生物安全柜內進行操作，白色念珠菌用0.85%無菌氯化鈉作為稀釋劑，黑曲霉用0.9%無菌氯化鈉作為稀釋劑，10倍梯度逐級稀釋至10-6，每種菌分別測定10-4～10-6三個稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)。用移液槍及滅菌移液槍頭各吸取1mL注入滅菌平皿，每種菌每個梯度制備2個平行。注入約20mL，45℃～50℃的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，隨即轉動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，翻轉平皿，置28℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)72h后，進行菌落計數(shù)。先用肉眼觀察，必要時可用放大鏡，點計菌落數(shù)，記下各平皿的菌落數(shù)后，求出每種菌的平均菌落數(shù)，換算成每種菌1 MCFARLAND的菌含量。

五、結果與討論

每種菌獨立重復三次實驗，計算三次重復實驗每種菌1MCFARLAND所含的平均菌落數(shù)。結果如下表：

由表1可以看到：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、白色念珠菌以及黑曲霉每1MCFARLAND采用活菌計數(shù)法計數(shù)所得的菌液含量具有良好的重現(xiàn)性，三次獨立重復實驗測定的菌液含量相對偏差小于50%。菌液的比濁度與菌體的大小有有關，菌體越大，相同比濁度的菌液含量越少。

六、結論

通過本實驗證實，菌液含量（CFU/mL）與菌液的比濁度（MCFARLAND）有良好的相關性，可將實驗用菌懸液調節(jié)至1MCFARLAND，通過活菌計數(shù)法確定實驗用菌懸液的含量，以便較準確的預估實驗用菌株濃度及所需要稀釋的級別。用平板制備的菌落，可采用適宜的稀釋劑作為比濁儀的空白對照，調零。此方法特別適用于枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞桿菌等在液體培養(yǎng)基上易形成塊狀或絮狀物等不易打散的菌液的計數(shù)。若采用液體培養(yǎng)基增菌的菌液則用相應的液體培養(yǎng)基作為比濁儀的空白對照，調零。

由于實驗室間條件差異；培養(yǎng)基產地、批號不同；操作人員與系統(tǒng)誤差等原因，同一菌種比濁度對應的菌液含量會有一定差異，建議在同一實驗室一旦有因素變化，應再重新確定菌種比濁度對應的菌液含量。

參考文獻：

[1]朱艷靜，李宇.測定菌體濃度的簡便方法[J].上海市工業(yè)微生物研究所，2002，第36卷第4期：47-49.

[ 2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[ M ].四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版，2015： 1105.endprint