孫昆俊 馬洪 康穎倩 鄒賢玉

口腔鱗癌患者與健康人唾液差異蛋白組學的初步研究

孫昆俊 馬洪 康穎倩 鄒賢玉

目的研究口腔鱗癌患者與健康人唾液蛋白差異表達情況。方法收集口腔鱗癌患者唾液17 例，健康人唾液17 例，通過以雙向凝膠電泳技術以及質譜鑒定和生物信息學分析，尋找在口腔鱗癌患者唾液中差異表達的蛋白質。結果選取口腔鱗癌患者和正常人唾液中具有明顯差異表達的10 個蛋白質點，進行質譜鑒定和生物信息學分析，共鑒定出3 種差異表達的蛋白質，其分別為 S100A8、S100A8/ S100A9及表皮角蛋白2(EK2)在口腔鱗癌患者唾液中均呈高表達。結論S100A8、S100A8/ S100A9及EK2可能與口腔鱗癌患者發(fā)生有關。

唾液； 口腔鱗癌； 蛋白質組學； 雙向電泳(2-DE)； 腫瘤標志物

長期以來，尋找早期診斷的惡性腫瘤標志物(tumor marker，TM)已成為了人們關注的焦點[1]。惡性腫瘤是一種涉及多種分子事件的疾病，其生長過程中由于基因突變、異常轉錄、和翻譯，必然會導致不同程度的蛋白質表達和修飾異常，而蛋白質組學的興起則為了解腫瘤蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系，從而揭示生物學行為以及基因表達調控機制提供了一個新的研究領域，并且目前發(fā)掘腫瘤標志物的強力工具正是蛋白組學方法和技術[2]。其還具備分析不同蛋白質組之間蛋白質在表達數量、表達水平和修飾狀態(tài)上的差異，研究差異蛋白質及其功能[3]。

本研究采用雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)技術分離口腔鱗癌患者和健康人的唾液蛋白，比較口腔鱗癌患者和健康人差異表達明顯的蛋白點，再應用基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-time of flight,MALDI-TOF/MS)以及生物信息學分析，尋找在口腔鱗癌患者唾液中特異蛋白質的變化，鑒定出這些差異表達的蛋白質種類和性質，以期發(fā)現在口腔鱗癌的早期診斷和治療上存在潛在的價值的腫瘤標志物，并為口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機制研究提供初步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究標本 標本來源于貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔頜面外科，未采用任何針對腫瘤的治療如手術、放療、化療等，且經病理證實口腔鱗癌患者唾液17 例，健康人唾液17 例?？谇击[癌唾液標本來源情況：男性14 例，女性3 例，年齡范圍55～68 歲，平均年齡55.8 歲。 其中高分化鱗癌10 例，中分化鱗癌6 例，低分化鱗癌1 例。健康人唾液標本來源情況：貴陽醫(yī)學院2010 級口腔頜面外科研究生及患者家屬，體檢均健康，既往無腫瘤史。

1.1.2 主要試劑 IPG Buffer和IPG膠條(13 cm，線性，pH 3～10)(GE Healthcare公司，美國)；廣譜蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Set I 10VL,AppliChem公司，德國)和BCA定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit 500 assa,北京康為世紀生物科技有限公司)；2D-clean up試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech公司，美國)；考馬斯G-250染料(Sigma公司，德國)等。

1.1.3 實驗儀器 紫外-可見光分光光度計(UV-1700PC型，上海奧析科學儀器有限公司)，超低溫冷凍離心機(Fresco 21型，Thermo Scientific公司，美國)；Image Scanner掃描儀、Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀、EPS601垂直電泳儀、Image Master 2D Platinum 6.0圖像分析軟件(Amersham Biosciences公司，美國)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本處理 所有研究標本采集均為清晨空腹漱口后15 min，并且口腔鱗癌患者唾液在術前采集，收集量一般為4～5 ml，經4 000 r/min離心5 min后置于-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白質樣本制備 取-80 ℃保存的患者唾液和正常對照唾液，室溫溶解后按丙酮沉淀法提取離心管底部白色綿絮狀物質，再按照2-D Clean up Kit試劑盒說明書操作進行蛋白純化及去除高峰度蛋白。

按照Bradford[4]法測定蛋白濃度。

雙向凝膠電泳(2-DE)分離蛋白。雙向凝膠電泳(2-DE)所用儀器：Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀、Electrophoresis Power Supply-EPS601垂直電泳儀、Image Master 2D Platinum 6.0圖像分析軟件(Amersham Biosciences公司，美國)。

1.3 凝膠圖像分析

染色后凝膠由Image Scaner采集圖像，運用Image Master 2D Platinum 6.0軟件進行圖像分析，按照Corbett[5]方法篩選差異蛋白斑點。

MALDI-TOF/MS(中國科學院上海生命科學研究院蛋白質組研究分析中心)質譜分析及數據檢索。

2 結 果

2.1 雙向電泳結果

選取在鱗癌患者和健康人唾液中差異表達明顯的10 個蛋白點進行質譜鑒定。結果如圖 1所示(均為考馬斯亮藍R250染色)。

圖 1 唾液蛋白2-DE圖譜

2.2 候選蛋白的MALDI-TOF/MS質譜分析聯(lián)合數據庫檢索結果

10 個蛋白標本經過質譜鑒定和數據庫檢索后，得分均超過50 分。10 個差異蛋白點質譜鑒定和數據庫查詢結果見表 1。

3號樣品經過氨基酸覆蓋率及經過二級質譜(MS/MS)鑒定為鈣結合蛋白(Calprotectin)，綜合得分為332;6號樣品鑒定為鈣結合蛋白同型蛋白(Calprotectin)，綜合得分為410；8號樣品經過氨基酸覆蓋率及經過二級質譜(MS/MS)鑒定為表皮角蛋白2( Epidermal cytokeratin 2)，綜合得分為153。

3 討 論

口腔腫瘤蛋白質組學研究一方面建立口腔腫瘤的全蛋白表達譜，可以用于腫瘤的分離鑒定；另一方面研究腫瘤與正常細胞的差異表達，篩選出各種病損的特異蛋白，構建腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白組譜和分子機制，發(fā)現與評估組織、血清、唾液中的特異蛋白作為生物標記，國外已有學者運用于頭頸鱗癌臨床無創(chuàng)傷早期診斷、分級和預后的初步研究[6-7]。但由于口腔鱗癌患者的唾液蛋白研究缺乏理想的模式，近幾年來對于唾液蛋白在口腔鱗癌的發(fā)病機制的研究尚未獲得突破性的進展，因此尋求更為前沿的技術，在客觀上利于對口腔鱗癌的病因學機理、診斷及預后評估等進行研究。因此，通過蛋白組學鑒定口腔鱗癌患者與健康人唾液中蛋白的方法在篩選不同侵襲能力細胞系之間差異蛋白質方面具有應用價值[8-9]。

表 1 10 個差異蛋白點質譜分析和數據庫查詢結果

注： ↑: 與健康人相比蛋白表達量升高，↓: 表達降低

本實驗初步鑒定出在口腔鱗癌患者唾液中呈高表達的3 個蛋白點(3、6、8號)分別是S100A8/ S100A9、S100A8、表皮角蛋白2。類似工作國內尚未見有關文獻報道。

S100A8/S100A9和S100A8在S100蛋白家族中又分別被稱為MRP8、MRP14，由于骨髓和上皮細胞中的S100A8和S100A9能通過腫瘤分泌的可溶性因子VEGF-A、腫瘤生長因子b(tumor growth factor b，TGFb)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)被誘導表達， 因此其被認為是與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展最緊密相關的因子[10]。兩者均可作為中性粒細胞強有力的誘導劑起到化學趨化性和黏附性作用，并且除了在炎癥反應過程中展現關鍵作用外，還具備抑制生長、促使細胞凋亡的功能，包括促使腫瘤細胞的凋亡[11]。因此，S100A8、S100A9蛋白在急、慢性炎癥反應中存在差異表達，可作為中性粒細胞抗腫瘤的效應器分子中的一員。并且S100A8及S100A8/A9在細胞外不僅參與調節(jié)細胞內鈣及信號轉導，同時也作為機體內多種生物學功能的調和劑之一，對細胞骨架結構、細胞形態(tài)變化產生影響[12]。本課題組[13]前期通過研究口腔鱗癌患者和健康人的組織蛋白差異表達，發(fā)現口腔鱗癌組織中S100A8和S100A9顯著表達，健康人組織中無表達。Hu等[14]也通過2-DE和LC-MS/MS技術，鑒定出口腔鱗癌患者唾液中S100A9蛋白過表達，而正常人唾液中未發(fā)現S100A9表達。

表皮角蛋白2(epidermal cytokeratin 2,EK2)是由一類后期表皮細胞骨架蛋白在后期分化過程中合成的II型細胞角蛋白，主要存在于鱗狀上皮、肌上皮、外分泌腺導管上皮等細胞中，而在腫瘤組織中呈特異表達，并隨分化程度、細胞生長環(huán)境或病理的改變而發(fā)生變化。然而表皮角蛋白除了具備相應的生理功能外，還參與了細胞增殖調控、細胞特異性的細胞器運輸、惡性轉化及各種應激反應，而且其參與惡性轉化的能力已有相關研究指出，惡變的鱗狀上皮具有大分子角蛋白(Ⅰ型)含量減少、小分子角蛋白(Ⅱ型)增多及小分子與大分子角蛋白共存2 大特征。后期國外學者研究發(fā)現[15]通過2-DE和MALDI-TOF/MS技術，比較頭頸部癌患者血清與正常人血清差異蛋白表達時，其中篩選出EK2在病理血清中呈上調表達。由此證明癌細胞的分化與功能都會影響到EK 的表達，以此來推測癌細胞的功能狀態(tài)是可能的。

本實驗采用雙向凝膠電泳技術結合MALDI-TOF/MS質譜鑒定技術先后對口腔鱗癌唾液凝膠差異表達明顯的10個蛋白點進行質譜鑒定，結果提示S100A8/ S100A9、S100A8及EK2在口腔鱗癌患者唾液中均呈高表達，但其具體機制有待進一步研究。

(致謝: 本研究中MALDI-TOF/MS質譜分析由中國科學院上海生命科學研究院蛋白質組研究分析中心完成)

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Aprimarystudyofthedifferentialproteomicexpressioninsalivaofhealthpeopleandthepatientswithoralsquamouscellcarcinoma

SUNKunjun,MAHong,KANGYingqian,ZOUXianyu.

1. 550004Guiyang,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,FacultyofStomatology,GuiyangMedicalUniversity,China; 2.KeyLaboratoryofProteomicsofGuiyangMedicalUniversity,Guiyang

Objective： To study the differentially expressed proteins in saliva of health people and the patients with oral squamous cell carcinoma(OSCC).MethodsSaliva of 17 cases with OSCC and paired health subjects was collected, the proteins in the saliva were examined by two-dimensional gel electrophoresis(2-DE) separation, the proteins were examined by 2-DE separation, the saliva proteome dimensional electrophoresis profiles were obtained by MALDI-TOF/MS mass spectrometric identification, the information of the differentially expressed protein in OSCC group was studied by NCBI database bioinformatics analysis.Results10 proteins differentially expressed between the 2 groups were observed by mass spectrometry. Bioinformatics analysis showed that S100A8,S100A8/S100A9 and Epidermal cytokeratin 2(EK2) were highly expressed in the saliva of OSCC cases.ConclusionS100A8,S100A8/S100A9 and EK2 may be related to the development of OSCC．

Saliva;OralSquamouscellcarcinoma(OSCC);Proteomics;Two-dimensionalgelelectrophoresis(2-DE);Tumormarker

2007年貴州省優(yōu)秀人才省長基金[編號： 黔省專合字(2006)116號]

550004， 貴州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口腔頜面外科學教研室(孫昆俊 馬洪 鄒賢玉)； 貴州醫(yī)科大學蛋白組學重點實驗室(康穎倩)

馬洪 0851-86773514 E-mail: mahong1966@126.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.017

(收稿： 2017-01-28 修回： 2017-03-24)