張雅琳 孟賀 李金源 吳文慧 梁銳英

七葉一枝花-殼聚糖混合物作為義齒穩(wěn)固劑的生物安全性及生物相容性研究

張雅琳 孟賀 李金源 吳文慧 梁銳英

目的評價七葉一枝花-殼聚糖混合物的生物安全性及生物相容性。方法參照國家標準GB/T 16886.12-2005、YY/T 0279-1995及GBT16886.5-2003規(guī)定的方法，將七葉一枝花-殼聚糖混合物按0.1 g/ml的標準放入浸提介質(zhì)中，37 ℃條件下、浸提24 h制備浸提液，采用口腔黏膜刺激試驗、細胞毒性試驗以及流式細胞術(shù)初步評價七葉一枝花-殼聚糖混合物的生物安全性及生物相容性。結(jié)果金黃地鼠口腔黏膜與試樣接觸部位未見出血、腫脹，組織學觀察未出現(xiàn)病理性改變，七葉一枝花-殼聚糖混合物無口腔黏膜刺激性；對L929細胞無細胞毒性；對L929細胞的周期及凋亡無顯著影響。結(jié)論初步認為七葉一枝花-殼聚糖混合物具有良好的生物安全性和生物相容性。

七葉一枝花； 殼聚糖； 生物安全性； 生物相容性； 義齒穩(wěn)固劑

無牙頜患者牙槽骨的不斷吸收，使牙槽骨變窄、變矮，軟組織萎縮、松軟，導致全口義齒固位不良[1]。另外，由于全口義齒戴入口內(nèi)后，義齒基托與黏膜之間環(huán)境改變，更利于微生物的黏附與繁殖[2]，可導致義齒性口炎。義齒穩(wěn)固劑又稱義齒黏附劑，是具有粘接性能的制劑，作用于義齒基托組織面，使義齒與黏膜緊密黏附，達到提高義齒固位和穩(wěn)定的作用[3]，理想的黏附時間為12～16 h。進口的義齒穩(wěn)固劑能夠在一定程度上增強義齒固位，提高咀嚼效率，但不能預(yù)防或治療義齒性口炎。中藥七葉一枝花具有抗菌、抗病毒、消炎等作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)，七葉一枝花對口腔臨床常見病原菌的生長均有抑制作用，對口腔細菌性疾病的臨床治療具有潛在的藥用價值。殼聚糖是甲殼質(zhì)的初級衍生物，具有較高的生物黏性和黏膜吸附性，并且有良好的生物相容性和很好的機械性能[4-5]，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、食品等各領(lǐng)域。本實驗利用七葉一枝花與殼聚糖制備的混合物作為義齒穩(wěn)固劑，采用口腔黏膜刺激試驗、細胞毒性實驗和流式細胞術(shù)評價其生物安全性及生物相容性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與藥品 L929細胞株(華北理工大學實驗室提供)；水溶性殼聚糖(河南華康生物科技有限公司)；七葉一枝花(北京同仁堂醫(yī)藥公司)。

1.1.2 實驗動物 60～70 d健康雄性金黃地鼠10 只，口腔雙側(cè)頰囊黏膜無病變。

1.1.3 主要試劑與儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)；二甲基亞砜(Amresco，美國)；細胞培養(yǎng)箱(Hera Cell 150，Heraeus，德國)；高速離心機(Sorvall Super T 21，Dupont，美國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD，美國)；流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 口腔黏膜刺激試驗 七葉一枝花-殼聚糖混合物的制備：將經(jīng)水煎法提純的七葉一枝花粉劑0.05 g溶于32 ml純水中攪拌溶解，加入水溶性殼聚糖0.64 g，攪拌混勻后得到淺棕色半透明混合物，每次實驗均配制新溶劑。根據(jù)本課題組前期實驗通過粘接抗張強度的測定以及抑菌圈實驗得知，此配制比例中，殼聚糖為最高黏度中的最低用量，七葉一枝花為抑制白色念珠菌的最小濃度[6]。將40 g新制備的七葉一枝花-殼聚糖混合物浸泡于200 ml生理鹽水，37 ℃條件下浸提5 d，提取上清液100 ml作為材料浸提液。

將動物隨機分為2 組，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后將直徑約5 mm的浸有七葉一枝花-殼聚糖混合物浸提液的棉球置于第1組動物的左側(cè)頰黏膜極低處作為實驗組；浸有pH為2的醋酸的棉球置于第2組動物的左側(cè)頰黏膜極低處作為陽性對照；2 組動物的右側(cè)均放置生理鹽水棉球作為陰性對照[7]。分別于1、4、6、8h進行肉眼觀察后取與試樣接觸部位頰黏膜及周圍組織，常規(guī)固定、HE染色后組織切片觀察。

1.2.2 體外細胞毒性實驗 浸提液的制備及分組：將七葉一枝花-殼聚糖混合物按0.1 g/ml的標準[8]放入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃條件下浸提24 h。將浸提液稀釋為100%、75%、50%、25%濃度的實驗組，另設(shè)陰性對照組(正常完全培養(yǎng)基)，Protefix義齒穩(wěn)固劑組(用完全培養(yǎng)基按0.1 g/ml標準浸提)，陽性對照組(含0.1%苯酚的完全培養(yǎng)基)。將L929細胞配制成最佳密度的細胞懸液(6×104/ml)接種于96 孔板，每孔200 μl，每組接種6 個復孔。24 h后棄去原培養(yǎng)液，各組加入相應(yīng)濃度的浸提液，分別于24、48、72、96 h時各取出一塊培養(yǎng)板，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，放入酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長下測吸光度值(A值)[9]。計算細胞相對增值率(RGR)，RGR=(各濃度組A均值/陰性對照組A均值)×100%，根據(jù)5 級毒性評價標準[10]對各組結(jié)果進行分級(表 1)。

表 1 細胞毒性分級

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡 將3 組生長狀況良好的L929細胞置換無血清培養(yǎng)基進行細胞同步化，繼續(xù)孵育24 h后隨機分為七葉一枝花-殼聚糖組、陰性對照組和陽性對照組，棄去原培養(yǎng)基，分別置換等體積相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3.1 細胞周期檢測 收集3 組細胞，PBS沖洗3 次，70%冰乙醇固定。核糖核酸酶消化，碘化丙啶(propidium iodide，PI) 室溫染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.2.3.2 細胞凋亡檢測 收集3 組細胞，PBS沖洗3 次，計數(shù)1×106個細胞加入 2 ml刻度EP管中，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，加入500μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，避光下加入2 μl AnnexinV-FITC 混勻，加入5 μl PI混勻，室溫避光15 min后上機檢查。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 口腔黏膜刺激試驗

肉眼觀察：分別于1、4、6、8 h時觀察，棉球在位情況良好無脫落，所有實驗動物無全身不良反應(yīng)，與七葉一枝花-殼聚糖混合物接觸的頰黏膜無紅腫、糜爛及潰瘍等現(xiàn)象，而與醋酸接觸的黏膜有顏色異常、充血、紅腫等反應(yīng)。

組織學觀察：與陽性對照材料接觸的黏膜上皮可見水腫增厚、糜爛及慢性炎細胞浸潤等病理改變;固有層可見水腫,血管擴張、充血及灶性慢性炎細胞浸潤(圖 1A)。與試驗材料七葉一枝花-殼聚糖混合物接觸的全部動物黏膜上皮完整,無血管擴張及炎細胞浸潤(圖 1B)。

A： 陽性對照組； B： 浸提液組

表 2 細胞毒性測定結(jié)果(n=6)

Tab 2 Results of cytotoxicity assay(n=6)

2.2 體外細胞毒性實驗

各組不同時間點的平均A值，RGR 值及毒性分級結(jié)果見表 2。

2.3 各實驗組對細胞周期及凋亡的影響

各組細胞凋亡率和細胞周期分布情況見表 3，圖 2～3。七葉一枝花-殼聚糖混合物浸提液組對細胞周期無特殊影響(P>0.05)，與陰性組間凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

Tab 3 Apoptosis and cell cycle of L929 cells(%，n=3，±s)

A： 陰性組； B： 浸提液組

A： 陰性組； B： 浸提液組

3 討 論

全口義齒固位不良不僅影響患者的咀嚼效率及美觀，還會影響義齒的穩(wěn)定，進而引起黏膜潰瘍或大范圍黏膜損傷。另外，全口義齒在口內(nèi)佩戴一段時間后表面易聚集菌斑而導致義齒性口炎，而白色念珠菌感染是義齒性口炎的重要致病因素[11-12]。因此，我們在前期實驗的基礎(chǔ)上將七葉一枝花-殼聚糖混合物作為義齒穩(wěn)固劑，進一步對其進行初期的生物安全性和生物相容性評價，為將來其作為義齒穩(wěn)固劑應(yīng)用于臨床提供一定的實驗依據(jù)。

口腔黏膜刺激試驗主要用于評價牙科材料對口腔黏膜產(chǎn)生的刺激作用，最接近材料的使用環(huán)境,而金黃地鼠的頰囊結(jié)構(gòu)特殊，是黏膜刺激試驗的良好實驗環(huán)境[13]。從實驗結(jié)果來看,七葉一枝花—殼聚糖混合物對口腔黏膜的刺激反應(yīng)與陰性對照組無顯著差異，表明該材料對口腔黏膜無不良刺激,在黏膜刺激試驗中表現(xiàn)出良好的生物安全性。

MTT比色法是一種檢測體外培養(yǎng)細胞生長存活的方法，其染色原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為不溶于水的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。結(jié)晶甲瓚經(jīng)二甲基亞砜溶解后于酶標儀比色，可根據(jù)測得的A值判斷活細胞數(shù)量[14]。本研究通過MTT實驗檢測七葉一枝花-殼聚糖混合物對L929細胞的毒性結(jié)果在第1天為0 級，第2天、第3天及第4天為1級，均屬于安全范圍，并且義齒穩(wěn)固劑在口腔內(nèi)存留時間不會超過義齒佩戴時間，一般為8～12 h，24 h之內(nèi)七葉一枝花-殼聚糖混合物的細胞毒性為0 級，證實七葉一枝花-殼聚糖混合物作為義齒穩(wěn)固劑是一種安全的口腔材料。

流式細胞儀的實驗結(jié)果顯示，七葉一枝花-殼聚糖混合物浸提液與正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞S期、 G2期細胞比例及細胞凋亡率差異無顯著性，反映了七葉一枝花-殼聚糖混合物與正常培養(yǎng)基相比對細胞行為功能無顯著影響，具有良好的生物相容性。

本實驗通過黏膜刺激試驗、細胞毒性試驗和流式細胞術(shù)分別在動物水平和細胞水平初步證實七葉一枝花-殼聚糖混合物具有良好的生物安全性和生物相容性。然而，本實驗仍為初期篩選實驗，對臨床應(yīng)用材料的生物安全性和生物相容性的全面評價仍需結(jié)合一系列生物安全性測試(如皮膚致敏試驗、長期毒性試驗及溶血試驗等)才能完成。

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ThebiologicalsafetyandbiocompatibilityevaluationofthemixtureofParispolyphylla-chitosanfordentureadhesive

ZHANGYalin,MENGHe,LIJinyuan,WUWenhui,LIANGRuiying.

063000Tangshan,DepartmentofProsthodontics,SchoolofStomatology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,China

Objective: To study the biological safety and biocompatibility of the mixture of Paris polyphylla-chitosan.MethodsAccording to the GB/T 16886.12-2005 standard, YY/T 0279-1995 standard and GBT16886.5-2003 standard, samples were prepared and tested by oral mucous membrane irritation test, cytotoxicity test and flow cytometry.ResultsNo local response to the mixture of Paris polyphylla-chitosan was found, and the visual observation and pathological findings of oral mucosa were normal and similar to that of the control group. Therefore, the mixture of Paris polyphylla-chitosan had no irritation response to oral mucosa.The mixture of Paris polyphylla-chitosan showed no cytotoxicity to L929 cells,and did not affect the cycle distribution and apoptosis of L929 cells.ConclusionThe mixture of Paris polyphylla-chitosan has good bio-safety and biocompatibility.

Parispolyphylla;Chitosan;Biologicalsafety；Biocompatibility；Dentureadhesivecream

063000 唐山, 華北理工大學口腔醫(yī)學院修復教研室

孟賀 E-mail： menghe10.2@163.com

R783.6

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.010

(收稿： 2017-03-01 修回： 2017-06-15)