陳志紅 易杰 黃桂林 張霓霓 姚禮 張立剛

抗菌治療對(duì)兔頰VX-2鱗癌感染性微環(huán)境中樹突狀細(xì)胞的影響

陳志紅 易杰 黃桂林 張霓霓 姚禮 張立剛

目的探索抗菌治療對(duì)兔頰VX-2鱗癌感染性微環(huán)境中樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)成熟及功能的影響。方法瘤粒植入形成兔頰VX-2鱗癌后，附加機(jī)械創(chuàng)傷及高糖飲食獲得該鱗癌的炎癥模型，再分為3 組(n=6)，A組：頰癌炎癥模型使用抗生素治療3 d；B組：頰癌炎癥模型以生理鹽水代替抗生素對(duì)照；C組：?jiǎn)渭冾a癌不做處理。3 d后收集各組腫瘤標(biāo)本，制成勻漿，取上清液與正常兔外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表達(dá)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)DCs刺激T細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果HLA-DR、CD83、CD86陽(yáng)性率及刺激指數(shù)(stimulate index,SI)由高到低均分別為：C組>A組>B組(P<0.05)。結(jié)論抗菌治療有助于感染兔頰VX-2鱗癌微環(huán)境中樹突狀細(xì)胞的成熟及功能恢復(fù)。

抗菌治療； 炎癥； VX-2鱗癌； 樹突狀細(xì)胞

自1990 年以來，全球范圍內(nèi)口腔癌的發(fā)病率及其在全身各系統(tǒng)中發(fā)生腫瘤所占比例逐年上升[1]?？谇恢羞m宜的溫度及濕度、大量的食物殘?jiān)凹?xì)菌，以及口腔癌患者在語(yǔ)言或進(jìn)食時(shí)牙齒、食物等對(duì)腫瘤造成創(chuàng)傷等原因，導(dǎo)致口腔癌患者腫瘤局部常常伴有感染，出現(xiàn)疼痛、出血等癥狀。近年的研究證實(shí)了炎癥與腫瘤的發(fā)生有著明顯的因果關(guān)系[2]，但口腔癌繼發(fā)局部感染后是否會(huì)導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中與免疫相關(guān)的細(xì)胞發(fā)生功能改變，抗菌治療能否對(duì)患者的局部免疫功能產(chǎn)生影響，在我們檢索的文獻(xiàn)中還未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過建立兔頰VX-2鱗癌感染性微環(huán)境模型，探索抗菌治療能否影響DCs表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表達(dá)及DCs的功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

種植于新西蘭兔后腿的VX-2荷瘤兔1 只，購(gòu)自中山大學(xué)。2～4 月新西蘭兔25 只，體重約1.5～2 kg，購(gòu)自重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

注射用普魯卡因青霉素(上海公誼獸藥廠)；替硝唑片(重慶科瑞制藥集團(tuán)有限公司)；兔外周血淋巴細(xì)胞分離液 (天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；APC-CD83、PE-CD86、FITC-HLA-DR、APC-IgG1、PE-IgG1、FITC-IgG2a抗體(BD公司,美國(guó))；尼龍毛(鄭州派和泰德醫(yī)藥科技有限公司)；活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(同仁化學(xué)研究所,日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 兔頰VX-2鱗癌模型的建立及干預(yù) 參照張林等[3]建模方法，取荷瘤兔大腿腫瘤制備成大小1 mm3的瘤粒，在無菌操作下植入到實(shí)驗(yàn)兔頰肌內(nèi)，約6～7 d腫瘤形成。實(shí)驗(yàn)第14天，在腫瘤部位切除體積1 cm×1 cm×0.3 cm的黏膜塊，形成局部創(chuàng)傷，術(shù)后全部實(shí)驗(yàn)兔予以高糖黏性牛奶飲用。實(shí)驗(yàn)第17天，腫瘤表面黏膜破潰紅腫，建模成功。根據(jù)不同的干預(yù)措施分成3 組，每組6 只，共18 只。A組：腫瘤伴炎癥，150 mg/kg替硝唑片灌胃，22 000 U/kg注射用普魯卡因青霉素肌肉注射；B組：腫瘤伴炎癥，20 ml生理鹽水灌胃，1 ml生理鹽水肌注；C組：?jiǎn)渭兘臃N的腫瘤，20 ml生理鹽水灌胃，1 ml生理鹽水肌注。1 次/d，連續(xù)3 d。實(shí)驗(yàn)第20天，完整切取所有腫瘤，部分標(biāo)本行HE染色，光鏡觀察。其余標(biāo)本以200 g/L與RPMI 1640培養(yǎng)基混合后制成勻漿, 3 000 r/min離心20 min×2 次,取上清液，存于-20 ℃冰箱內(nèi)。

1.3.2 兔外周血源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng) 取1 只正常新西蘭兔，經(jīng)皮穿刺心臟采血約15 ml，參照說明書分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×106/ml，再以1 ml/孔加入到6 孔板內(nèi)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置3 h，吸棄上清液，剩余細(xì)胞即為單核細(xì)胞。將1.3.1中所得上清液以0.22 μm過濾器過濾3 遍后與上述單核細(xì)胞一起培養(yǎng)。A組上清液1 ml+10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基2 ml；B組上清液1 ml+10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基2 ml；C組上清液1 ml+10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基2 ml。每組隔日半量換液，在培養(yǎng)第6天，收集各組細(xì)胞，相差顯微鏡和掃描電鏡(SEM)下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))檢測(cè)HLA-DR、CD83、CD86的表達(dá) 制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×106/ml，檢測(cè)活細(xì)胞率>95%。3 組分別取6 個(gè)樣本，每個(gè)樣本設(shè)實(shí)驗(yàn)管(100 μl細(xì)胞懸液，加入HLA-DR-FITC、CD83-APC、CD86-PE各10 μl)和對(duì)照管(100 μl細(xì)胞懸液，加入IgG2a-FITC、IgG1-APC、IgG1-PE各10 μl)，室溫避光孵育20 min，然后1 500 r/min離心10 min，棄上清，PBS清洗2 次，以0.5 ml PBS緩沖液混勻，再加0.5 ml 1%多聚甲醛固定，4 ℃冰箱避光保存，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HLA-DR、CD83、CD86的表達(dá)。

1.3.4 同種異源混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，靜置3 h后取懸浮細(xì)胞。參照考尼龍毛柱法，分離懸浮細(xì)胞中的T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/ml。3 組DCs中分別加入25 mg/L絲裂霉素C，培養(yǎng)箱中孵育30 min ，PBS清洗3次，懸于10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml。以3 組DCs為刺激細(xì)胞，T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，另設(shè)單純培養(yǎng)液對(duì)照組和陰性對(duì)照組(只添加T細(xì)胞)。將DCs和T細(xì)胞以 1∶5、1∶10、1∶20 的比例，每組3 復(fù)孔，混于96 孔板中，終體積200 μl。孵育72 h，然后每孔加入活細(xì)胞計(jì)數(shù)盒試劑20 μl，孵育3 h。酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS，芬蘭)于450 nm處檢測(cè)各組A值并計(jì)算刺激指數(shù)(stimulate index,SI),SI=(待測(cè)樣品孔A值-培養(yǎng)液對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-培養(yǎng)液對(duì)照組A值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兔頰VX-2鱗癌炎癥模型的病理學(xué)改變

制備炎癥模型后第3天，肉眼下見A組頰部黏膜破潰，腫瘤外露，稍紅腫，無明顯滲血；B組頰部黏膜破潰，腫瘤外露，腫瘤組織紅腫、滲血；C組兔頰部黏膜完整，未見明顯破潰。鏡下見各組腫瘤組織內(nèi)大量形態(tài)、大小不一的癌細(xì)胞，異型性明顯，其中A組鱗癌組織內(nèi)見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；B組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較A組多；C組則炎性細(xì)胞少見(圖 1)。

2.2 鏡下DCs形態(tài)

細(xì)胞培養(yǎng)第6天，相差顯微鏡下見部分細(xì)胞呈懸浮或半懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，并且聚集成團(tuán)(圖 2A)。掃描電鏡下見DCs表面有大量褶皺及長(zhǎng)短、粗細(xì)不等的突起(圖 2B)。

圖 1 各組VX-2鱗癌病理學(xué)觀察(HE， ×100)

Fig 1 Pathological observation of rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma in the 3 groups(HE, ×100)

圖 2 第6天DCs的形態(tài)(A: 相差顯微鏡, ×400； B： 掃描電鏡, ×5 000)

Fig 2 Morphology of DCs on the 6th day of cell culture(A: Phase microscope, ×400； B： SEM, ×5 000)

2.3 3 組DCs表型的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

3 組HLA-DR、CD83、CD86陽(yáng)性率F值分別為18.444、30.033、40.664，P<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明3 組中至少有2 組HLA-DR、CD83、CD86陽(yáng)性率不相等，進(jìn)一步使用LSD-t檢驗(yàn)兩兩比較，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 1)。

2.4 同種異源混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

3 組SI相比較的F值分別為12.579、30.042和15.245，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明3 組中至少有2 組SI不相等,進(jìn)一步行LSD-t檢驗(yàn)兩兩比較，結(jié)果P值均小于0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 2)。

表 1 3 組細(xì)胞表型的流式學(xué)分析

Tab 1 Flow cytometry analysis of the cell phenotype in the 3 groups

CD83CD86HLA-DRA組(n=6)2.13±0.3021.17±2.302.03±0.26B組(n=6)1.57±0.38①13.95±2.05①1.47±0.16①C組(n=6)2.60±0.18①②25.07±1.84①②2.63±0.33①②F值18.44440.66430.033P值0.0000.0000.000

注： ①與A組比較，P<0.01； ②與B組比較，P<0.01

表 2 3 組混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)刺激指數(shù)

Tab 2 Stimulate index of mixed lymphocyte reaction in the 3 groups

1∶51∶101∶20A組(n=6)1.518±0.0821.664±0.0321.530±0.086B組(n=6)1.390±0.078①1.553±0.057①1.431±0.044①C組(n=6)1.629±0.086①②1.741±0.028①②1.618±0.038①②F值12.57930.04215.245P值0.0010.0000.000

注： ①與A組比較，P<0.05； ②與B組比較，P<0.05

3 討 論

所謂腫瘤炎性微環(huán)境,就是指腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所處的炎性內(nèi)環(huán)境，主要包括腫瘤細(xì)胞、炎性細(xì)胞及炎性因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分、血管及淋巴管網(wǎng)絡(luò)等。由于大量炎性細(xì)胞及因子的存在，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成，使腫瘤微環(huán)境更加復(fù)雜多變[4]。

DCs是迄今為止體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞。在腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)著大量的DCs，可通過各種途徑發(fā)揮抗腫瘤免疫[5]。由于各種抑制因子的作用，使DCs加工及提呈抗原能力減弱[6-7]。在腫瘤炎性微環(huán)境中，大量的炎性細(xì)胞和炎性因子如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAM)、髓源性抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cell,MDSC)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、 IL-10等，可進(jìn)一步抑制DCs成熟及功能，導(dǎo)致免疫逃逸的發(fā)生。如：炎癥相關(guān)細(xì)胞MDSC可直接或通過產(chǎn)生大量Arg-1和iNOS間接抑制DCs的功能[8]。炎性因子IL-6可通過激活JAK2-STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)DCs功能障礙，削弱機(jī)體的免疫監(jiān)視[9]。IL-10不僅可通過下調(diào)DCs表面標(biāo)記分子MHC及B7的表達(dá)，使其無法提呈抗原至T細(xì)胞[10]，還可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)，Treg通過以下途徑進(jìn)一步阻止imDC的成熟[11]：(1)Treg較初始T細(xì)胞更易更快聚集在DCs周圍，阻斷DCs激活初始T細(xì)胞；(2)Treg抑制DCs表面CD80、CD86分子，使其無法提呈抗原至T細(xì)胞。另外，在腫瘤炎性微環(huán)境中VEGF也可通過各種途徑抑制DCs分化、成熟及功能[12]。

本實(shí)驗(yàn)首先建立兔頰VX-2鱗癌及其炎癥模型，連續(xù)3 d使用抗生素進(jìn)行抗感染治療，然后通過肉眼觀察到A組腫瘤表面紅腫、潰爛情況較B組明顯改善，鏡下見A組腫瘤組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較B組少。應(yīng)用VX-2鱗癌上清液體外模擬腫瘤微環(huán)境，并與兔外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)DCs表面分子HLA-DR、CD83、CD86表達(dá)情況及其刺激T細(xì)胞增殖能力。3 組結(jié)果顯示：HLA-DR、CD83、CD86分子表達(dá)情況及SI均為C組>A組>B組(P<0.05)。由此可見炎癥對(duì)DCs細(xì)胞成熟及功能的影響，A組、B組DCs的成熟及功能受到不同程度的抑制，尤其是B組，HLA-DR、CD83、CD86分子表達(dá)及SI同A組相比，均明顯降低。由此筆者推測(cè)：通過抗菌藥物抗感染治療后，兔頰VX-2鱗癌局部環(huán)境中感染性炎癥得到控制，炎性細(xì)胞及炎性因子的釋放減少，對(duì)DCs分化成熟及功能的抑制作用也隨之減弱。也就說明了在兔頰VX-2鱗癌中，感染性炎癥能抑制DCs分化成熟及功能發(fā)揮。這提示臨床醫(yī)生應(yīng)該及時(shí)處理口腔癌患者的局部感染，如避免過硬及刺激性食物，摘除腫瘤旁的不良修復(fù)體、拔除殘根殘冠等，保持局部清潔，必要時(shí)可適當(dāng)進(jìn)行全身抗感染，避免腫瘤進(jìn)一步惡化，及早手術(shù)。這都有利于患者體內(nèi)DCs的分化成熟及功能發(fā)揮，提高免疫力。

感染性炎癥抑制DCs成熟及功能的中間環(huán)節(jié)仍不清楚，需進(jìn)一步研究炎癥對(duì)DCs影響的機(jī)制，從而有效阻斷其信號(hào)通路，促進(jìn)DCs成熟及功能發(fā)揮。

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TheeffectsofantimicrobialtherapyondendriticcellsintheinfectedmicroenvironmentofrabbitbuccalVX-2squamouscellcarcinoma

CHENZhihong1,YIJie2,HUANGGuilin2,ZHANGNini2,YAOLi2,ZHANGLigang2.

1. 550002Guiyang,DepartmentofStomatology,People'sHospitalofGuizhouProvince,China; 2.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,StomatologicalHospital,ZunyiMedicalCollege

Objective: To study the effects of antimicrobial therapy on the maturation and function of dendritic cells(DCs) in the infected microenvironment of rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma.MethodsThe inflammatory models were obtained by mechanical trauma and high sugar diet on the basis of rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma models which were established by particle implantation of the tumor tissue. The model rabbits were divided into 3 groups(n=6). In group A the rabbits with buccal VX-2 squamous cell carcinoma and local inflammation were given antibiotics by gavage and intramuscular injection for 3 consecutive days; the rabbits in group B with buccal VX-2 squamous cell carcinoma and local inflammation were given normal saline by gavage and intramuscular injection; the rabbits in group C with tumor and without inflammation were given normal saline by gavage and intramuscular injection.The tumor specimens were collected 3 days after treatment, and made into tissue homogenate, supernatant was collected after centrifugation.Normal rabbit peripheral blood mononuclear cells were separated and co-cultured with the supernatant obtained from the 3 groups respectively. Expressions of DCs surface markers HLA-DR,CD83 and CD86 were detected by flow cytometry. the function of DCs was tested by mixed lymphocyte reaction.ResultsThe positive rate of HLA-DR,CD83,CD86 and stimulate index were group C>group A>group B(P<0.05).ConclusionAntimicrobial therapy can promote the maturation and function of DCs in the infected microenvironment of rabbit buccal VX-2 squamous cell carcinoma.

Antimicrobialtherapy;Inflammation;VX-2squamouscellcarcinoma;Dendriticcells

貴州省科學(xué)技術(shù)基金(編號(hào)： 黔科合J字LKZ[2013]36號(hào)，黔科合J字LKZ[2011]23號(hào))； 遵義市紅花崗區(qū)科學(xué)技術(shù)局項(xiàng)目(編號(hào)： 遵紅科合社字[2015]09號(hào))； 貴州省研究生工作站項(xiàng)目(編號(hào)： 黔教研合YJSZ字[2013]08)

550002 貴陽(yáng)， 貴州省人民醫(yī)院口腔科(陳志紅)； 遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科(易杰 黃桂林 張霓霓 姚禮 張立剛)

黃桂林 E-mail: chaojiehuanghgl@163.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.005

(收稿： 2016-11-28 修回： 2017-04-25)