李紅文， 張 煒，李 喆，王旭蘭，王群讓，劉新宏，邢 坤，常鳳軍△

1.陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)三科 (西安 710068)，2. 咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院(咸陽 712000)，3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科(咸陽 712000)

冠心病患者體內(nèi)循環(huán)微粒對血管舒張功能的影響研究*

李紅文1， 張 煒1，李 喆1，王旭蘭2，王群讓3，劉新宏1，邢 坤1，常鳳軍1△

1.陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)三科 (西安 710068)，2. 咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院(咸陽 712000)，3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科(咸陽 712000)

目的：研究冠心病患者體內(nèi)循環(huán)微粒(MPs)對血管舒張功能的影響。方法：選取穩(wěn)定型心絞痛冠心病患者45例(實驗組)和健康體檢的健康志愿者20例(對照組)，分別抽取兩組患者的空腹靜脈血，采用兩步離心法提取MPs；然后用兩組MPs孵育離體SD大鼠胸主動脈，并檢測分析二者對血管舒張功能的影響及對一氧化氮(NO)含量的影響。結(jié)果：與對照組MPs比較，實驗組MPs明顯抑制了內(nèi)皮依賴的血管舒張功能和離體血管NO的產(chǎn)生。結(jié)論： 冠心病患者體內(nèi)的MPst通過抑制NO的產(chǎn)生損害內(nèi)皮依賴的血管舒張功能，提示MPs有作為內(nèi)皮功能受損標志物的潛能。

冠狀動脈性心臟病(Coronary heart disease，CHD)的發(fā)生發(fā)展與內(nèi)皮功能障礙及血小板的激活密切相關(guān)，內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變是CHD的早期共同病理變化。已有研究證實CHD患者的內(nèi)皮功能均受到不同程度的損害[1-2]。循環(huán)微粒(Circulating microparticles，MPs)是內(nèi)皮細胞、血小板等細胞激活或凋亡時以“出泡”的方式釋放到體內(nèi)的微小囊泡狀顆粒[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),MPs具有：促炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、促血栓反應(yīng)、影響血流動力學(xué)等作用[5-6]。MPs是否參與和影響了CHD的發(fā)生發(fā)展及可能的作用機制尚不明確。本研究將通過比較正常志愿者及CHD患者的MPs多血管舒張功能及其相關(guān)的自由基的影響的差異，初步探討MPs在CHD發(fā)生發(fā)展中的作用。

資料與方法

1 一般資料 選取2016年3-9月就診于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科的CHD患者45例(45例)，男23例，女22例，年齡42～68(50.53±12.37)歲，體重指數(shù)(22.26±0.93)kg/m2。排除患有高血壓、2型糖尿病、腎功能衰竭、嚴重感染性疾病等可能會影響MPs含量疾病的患者。另外選取陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢20例,男10例，女10例，年齡40～ 60( 48.62±10.4)歲，體重指數(shù)(21.63±0.89)kg/m2；兩組一般資料比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。所有參與者均自愿簽署知情同意書。

2 MPs提取 入院當(dāng)天抽兩組空腹靜脈血，按照文獻[7]提取MPs：將空腹靜脈血低溫離心(4℃ 4000 rpm，10 min)，提取上層血漿再次離心(4℃ 11000 g ，2 min)，上層血漿為乏血小板血漿。取2 ml 乏血小板血漿進行最后一次離心(4℃ 13000 g ，45 min)，將沉淀于離心管底部的MPs 用100 μl 的RPMI1640 培養(yǎng)基(美國，GIBCO公司)重懸，經(jīng)BCA蛋白濃度進行測定(試劑盒：美國，Thermo Scientific 公司)其濃度，存放于4℃冰箱備用。

3 血管舒張功能檢測 配置Kreb’s平衡液(NaCl 119.0 mmol/L,NaHCO325.0 mmol/L glucose 11.1 mmol/L,CaCl21.6 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,MgSO41.2 mmol/L,pH 7.4，所用試劑均為國產(chǎn)分析純)。經(jīng)斬頭處死大鼠(陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供)后，迅速開胸取其胸主動脈，并放置于預(yù)冷、通氣(95% O2與 5% CO2的混合氣)Kreb’s平衡液中，仔細剔除動脈周圍脂肪組織后將動脈平均剪為3 ～ 4 mm血管環(huán)。將血管環(huán)連接至含有Kreb’s平衡液(37℃，通氣)的BL-420E+生物機能試驗系統(tǒng)(中國，成都泰盟科技有限公司)內(nèi)。讓血管環(huán)在儀器內(nèi)平衡90 min后進行血管舒張功能檢測。經(jīng)等量的兩組MPs孵育血管環(huán)30 min后，首先用苯腎上腺素(10-6mol/L，美國，Sigma公司)刺激血管收縮至平臺期，然后依次加入10-7～ 10-4mol/L 的乙酰膽堿(美國，Sigma公司)檢測MPs對血管舒張功能的影響(設(shè)空白對照組，不做任何藥物孵育，其余處理與對照組、實驗組一致)。

4 NO檢測 經(jīng)斬頭處死大鼠后迅速開胸取大鼠胸主動脈，將取出的胸主動脈放置于預(yù)冷并通氣的Kreb’s平衡液中，仔細剔除動脈周圍脂肪組織后將血管縱行剖開并放入DMEM培養(yǎng)基(美國，GIBCO公司)的6孔板內(nèi)，將6孔板放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定1 h后分別加入等量的兩組MPs孵育30 min(設(shè)空白對照組，不做任何藥物孵育；設(shè)陽性對照組，血管內(nèi)皮舒張因子(VEGF，50 ng/ml)孵育30min)。孵育結(jié)束后取培養(yǎng)基進行NO檢測(試劑盒：南京建成生物科技公司)，將各孔內(nèi)血管環(huán)烘干稱重用于計算NO含量(μmol/g 蛋白)。

結(jié) 果

1 兩組血脂及MPs含量情況 實驗組血脂及MPs含量較對照組高，分別比較均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P均<0.05)，見表1。

2 兩組MPs對血管舒張功能的影響 與空白組組比較， 對照組MPs不影響血管舒張功能，實驗組MPs一定程度上抑制了血管舒張功能(圖1)

表1 兩組臨床資料比較

注：與對照組比較，*P<0.05

3 兩組對一氧化氮含量的影響 與空白組比較，陽性對照組(VEGF組)明顯離體血管刺激NO產(chǎn)生(提示實驗操作有效)；對照組MPs對離體血管NO的產(chǎn)生無影響，實驗值MPs一定程度上抑制了離體血管NO的產(chǎn)生(圖2)。

討 論

冠心病的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的級聯(lián)損傷反應(yīng)，也涉及到血管內(nèi)皮細胞損傷后細胞形態(tài)學(xué)的改變[8]。本研究通過比較CHD患者的MPs和健康志愿者的MPs對血管舒張功能的影響發(fā)現(xiàn)：與對照組MPs比較，實驗組MPs抑制了離體血管NO的產(chǎn)生和血管舒張功能。我們的研究一定程度上闡明了MPs參與CDH發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制。

近年來，CHD的發(fā)生率、致死率和致殘率逐年身高。研究發(fā)現(xiàn)，冠心病的發(fā)生發(fā)展危險因素有：血脂異常、高血壓病史、吸煙史、炎癥因子、凝血激活、內(nèi)皮功能紊亂等[9-10]。臨床研究顯示，狼瘡抗凝物(LA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、高血壓、先兆子癇和糖尿病患者血漿中MPs水平升高,MPs數(shù)量及功能的檢測可以為評估和監(jiān)測血栓性及炎癥性疾病中的內(nèi)皮損傷情況[3-4]。研究認為，MPs不僅是內(nèi)皮功能受損的標志物，更在凝血狀態(tài)、炎癥反應(yīng)、血管功能障礙等方面起到重要作用[11]。還有研究顯示，MPs通過抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達影響離體心臟血管新生[12]。研究發(fā)現(xiàn)，重度主動脈瓣狹窄患者體內(nèi)MPs水平較正常人升高，而其原因在于瓣膜口狹窄所形成的切應(yīng)力以及血流動力學(xué)改變所致[6]。研究認為，MPs不僅僅是內(nèi)皮損傷的產(chǎn)物，同時MPs又反過來加重心臟瓣膜損傷，進而形成“惡性循環(huán)”[13]。鑒于MPs的上訴作用，本研究選取正常人和CHD患者為研究對象，以血管舒張及與血管舒張密切相關(guān)的NO為研究手段檢測MPs在CHD發(fā)生發(fā)展中的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)CHD患者體內(nèi)的MPs含量較正常對照組明顯升高，而且這一升高的MPs抑制了血管舒張功能，我們的結(jié)果不僅驗證了前人的理論，而且用實驗證實了MPs可以抑制血管內(nèi)皮舒張功能。

NO 由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生和釋放，可以阻斷血管內(nèi)皮損傷和舒張血管，NO 生物學(xué)活性降低意味著內(nèi)皮細胞功能出現(xiàn)損傷或障礙[14]。內(nèi)皮功能的異常主要表現(xiàn)為 NO 水平下降和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強。既往研究已經(jīng)證實 MPs 可以降低內(nèi)皮細胞 NO 釋放[15]。Chang JP和 Corradi D研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)在二尖瓣疾病的內(nèi)皮功能損傷起重要作用。 eNOS 脫耦聯(lián)是導(dǎo)致 NO 水平下降和 O2-水平升高的重要機制[16]。本研究顯示，來自CHD患者的MPs抑制了離體大鼠胸主動脈NO的產(chǎn)生，進一步檢驗了MPs抑制血管舒張功能的分子生物學(xué)機制：CHD患者體內(nèi)的MPs可能是通過抑制血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生NO而抑制了血管內(nèi)皮舒張功能，而血管內(nèi)皮功能的受損可能會反過來進一步增加MPs的釋放，最終形成“惡性循環(huán)”而參與了CHD的發(fā)生發(fā)展。由于MPs來源的廣泛性(內(nèi)皮源、血小板源、白細胞源等)， 而目前尚無方法可以從血液中分離出不同來源的MPs,所以此次研究所用的MPs為混合型的，將來分離提存MPs新方法的出現(xiàn)將有利于更深入的研究MPs與CHD及內(nèi)皮功能的關(guān)系。

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Effectofcirculatingmicroparticlesonvasodilatationincoronaryheartdisease

Li Hongwen,Zhang Wei,Li Zhe,et al.

Department of Cardiology,Shaanxi People's Hospital(Xi’an 710068)

Objective: To study the effect of circulating microparticles (MPs) from patients with coronary heart disease (CHD) on vasodilatation. Methods: Fasting venous blood from healthy volunteer (n=20) and stable angina pectoris patients (n=45) were obtained. Two steps’ centrifugation was used to get MPs from CAHD patients (experimental group) and normal volunteers (control group). Then,effect of MPs on vasodilatation,generation of nitric oxide (NO) of isolated thoracic aorta from SD rats were performed. Results: Compared with control group,MPs from experimental group inhibited the endothelial-depentmend vasodilatation,reduced the generation of NO. Conclusion: MPs from CHD patients inhibited vasodilatation by reduction NO,which indicated that MPs maybe a potential marker of endothelial dysfunction.

Coronary disease/physiopathology @Circulating microparticles Nitric oxide Vasodilatation

*國家自然科學(xué)基金專項基金資助項目(81341112)

△通訊作者

冠狀動脈疾病/病理生理學(xué) 循環(huán)微粒 內(nèi)皮細胞 一氧化氮 血管舒張

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.007

(收稿：2017-05-10)