安群星，黨 璇，胡興斌，易 靜，尹 文

第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院輸血科(西安 710032)

懸浮芯片HPA基因分型方法的建立及評價研究*

安群星，黨 璇，胡興斌，易 靜，尹 文△

第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院輸血科(西安 710032)

目的：建立一種準確、高通量的人類血小板抗原(HPA)基因分型方法。方法：采用多重PCR及連接酶技術擴增22種HPA基因，將擴增產(chǎn)物與包被在微球上的特異性探針雜交，通過Bio-Plex懸浮芯片閱讀儀判定HPA基因型，將檢測結果與聚合酶鏈反應-測序分型(PCR-SBT)結果比較。結果：成功建立了懸浮芯片HPA基因分型方法并對西安市漢族獻血者血液樣品進行基因分型，檢測結果與PCR-SBT分型結果完全一致。結論：真正建立了一種準確、高通量的HPA分型方法，對臨床血小板HPA分型輸注以及建立已知HPA供者庫具有重要意義。

人類血小板抗原(Human platelet antigen,HPA)是血小板糖蛋白攜帶的一類特異性抗原，目前發(fā)現(xiàn)有24種，其中22種HPA的基因結構已完全清楚。全面、準確地鑒定HPA型別，對于開展血小板HPA同型輸注，減低同種免疫反應的發(fā)生，以及建立已知HPA型別血小板供者庫等均具有重要意義。我們采用多重PCR及連接酶技術，將22種HPA基因型進行有效擴增。同時設計識別相應HPA基因片段上SNP位點的寡核苷酸探針，并將探針固定在微球上。然后將HPA擴增產(chǎn)物同包被探針的微球雜交，通過Bio-Plex懸浮芯片閱讀儀判定22種HPA的基因型。

材料與方法

1 主要試劑和儀器 熱啟動Taq DNA聚合酶購自美國Qiagen公司，DNA 連接酶購自美國NEB公司，磁珠購自美國Bio-Rad公司，嗎啉乙磺酸水合物購自美國Sigma公司，碳二亞胺鹽酸鹽購自美國Thermo Scientific公司， Gene Amp 9700 PCR擴增儀產(chǎn)自美國ABI公司，Bio-Plex 懸浮芯片儀產(chǎn)自美國Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 多重PCR擴增：根據(jù)GeneBank公布的各型HPA基因序列，在22個檢測位點的兩側設計擴增引物，設計擴增片段的長度100～500bp。以人基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系總體積20μl，擴增條件為95℃變性3min，95℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 30s進行5個循環(huán)，95℃ 30s、 55℃ 30s、72℃ 30s再進行30個循環(huán)，72℃延伸1min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳25min，具體操作參見文獻[1-2]。

2.2 連接反應：反應體系包括1× thermo stable ligase reaction buffer、多重PCR擴增產(chǎn)物1μl、連接探針0.2μM、thermo stable ligase 4U，反應總體積為20μl。連接反應條件為95℃變性3min，95℃ 30s、60℃ 30s共30個循環(huán)。

2.3 雜交反應：每孔加微球20μl、連接產(chǎn)物1.5μl，貼上封板紙并于振蕩器上震蕩10s。雜交反應條件為：94℃ 3min、50℃ 30min。反應結束后每孔加入熒光素80μl，50℃孵育10min。結果用Bio-Plex懸浮芯片閱讀儀檢測熒光信號。

2.4 聚合酶鏈反應-測序分型(PCR-SBT)：依照常規(guī)制備樣品基因組DNA，經(jīng)PCR后交由Genscript公司進行測序。

3 統(tǒng)計學方法 采用直接計數(shù)法，計算各型HPA-a、b的基因頻率和基因型頻率。

結 果

1 懸浮芯片分型方法的準確性分析 對100份獻血者血液樣品進行懸浮芯片HPA基因分型，其結果與被認為與金標準PCR-SBT分型結果完全一致。

2 懸浮芯片HPA分型結果 對313份西安市漢族獻血者血液樣品進行懸浮芯片HPA基因分型，分型結果見表1、2。

表1 懸浮芯片法檢測西安市漢族獻血者HPA基因型頻率

注：HPA-7～14、16的分型結果均為aa型

表2 懸浮芯片法檢測西安市漢族獻血者HPA基因頻率

討 論

基因芯片技術以一種系統(tǒng)、整體的方法，研究生物體基因的表達及功能[3]。血小板輸注是預防和治療因血小板減少或功能異常而引發(fā)出血性疾病的重要手段。由于目前HPA分型技術的局限性，臨床輸注血小板時多考慮ABO血型，而忽視了HPA血型相配合的問題。HPA不配合可導致一系列臨床同種免疫癥狀的出現(xiàn)，如新生兒同種免疫血小板減少癥(NAIT)、輸血后紫癜(PTP)及血小板輸注無效(PTR)等。全面、準確、有效地檢測HPA型別，開展HPA同型輸注，以及建立已知HPA供者庫，為患者提供相配合的血小板，對于促進臨床血小板輸注的安全性和有效性具有重要意義。

傳統(tǒng)的血清學分型方法，由于缺乏質量高、特異性強的抗血清，加之部分患者較難采集到足夠檢測樣品，使得HPA分型檢測難以開展。由于22種HPA抗原的基因序列已完全清楚,應用基因分型檢測成為可能。目前報道的基因分型方法有多種，包括聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)、PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針(ASO)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、PCR-直接測序分型(PCR-SBT)、基因芯片等[4-7]。目前這些方法雖有各自的優(yōu)點，但大部分還難以做到高通量，即難以一次性完成HPA 22個型別的檢測，也難以做到標準化判讀結果。同時，現(xiàn)存大部分檢測方法的準確性和特異性還有待進一步提高。這些因素障礙了臨床HPA的分型檢測和血小板同型輸注。

懸浮芯片技術(Suspension array technology,SAT)是美國Luminex公司發(fā)明的新一代生物芯片技術。SAT既是后基因組時代科學研究的技術手段，又是新一代高通量分子診斷的技術平臺。SAT系統(tǒng)主要由4種要素構成：微球、捕獲分子(抗原、抗體或核酸探針)、待檢分子、報告分子。微球主要用來固定和區(qū)分不同的捕獲分子。利用100種有顏色差別的熒光編碼微球，便可標記多達100種不同的探針分子，同時完成對一個標本多達100種的檢測反應。包被于微球上的捕獲分子既可為抗原和抗體，用于檢測蛋白質，也可為核酸探針，用于檢測核酸。將每種包被有相應捕獲分子的熒光編碼微球混懸于一個液相體系中，依次加入待檢標本及報告分子，即構成了一個懸浮芯片反應系統(tǒng)。SAT的檢測系統(tǒng)內(nèi)置有雙色激光發(fā)射器，產(chǎn)生的紅色激光可將微球分類，從而區(qū)分不同的檢測反應(定性作用)。產(chǎn)生的綠色激光用來激發(fā)報告分子上的綠色報告熒光，從而確定相應待檢分子的數(shù)量(定量作用)。利用懸浮芯片系統(tǒng)，可以對同一微量標本中的多個不同待檢分子同時進行快速的定性、定量分析。與其它檢測方法特別是與所謂“金標準”的ELISA方法相比，液相芯片在特異性、敏感性、簡易性、可靠性、多路性、成本及耗時7個方面均具有顯著優(yōu)勢，對于要求高通量、準確、簡便的HPA基因分型工作特別適用。

我們采用多重PCR及連接酶技術有效擴增22種HPA基因，將擴增產(chǎn)物與包被在熒光微球上的特異性探針雜交，通過Bio-Plex懸浮芯片閱讀儀判定HPA基因型，檢測結果與金標準方法PCR-SBT分型結果完全一致。我們真正建立了一種高通量、結果準確、操作簡單的HPA基因分型方法，為大樣本HPA分型檢測以及建立已知HPA供者庫提供了基石。

[1] 安群星，李翠瑩，陳 蕤，等. 人類血小板抗原基因分型參考品的制備及鑒定[J]. 中國輸血雜志,2011,24(5): 411-413.

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[7] 楊 華，巨 蓉. 促紅細胞生成素對缺氧缺血性腦病患兒血清NSE、S-100B水平的影響及作用機制研究[J]. 陜西醫(yī)學雜志,2016,45(7):887-889.

*陜西省科技計劃項目(2011K12-05-15)

△通訊作者

抗原，人血小板 @懸浮芯片 基因分型技術 微型芯片分析操作

R392

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.005

(收稿：2017-04-11)