霍建華，陳姝萍，盧 群，張 俊，白 玲，馬愛群，劉 平Δ

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(西安710061)，2.陜西省鎮(zhèn)安縣中醫(yī)院內(nèi)二科(鎮(zhèn)安711500)

冠狀動脈痙攣相關(guān)基因NOS3同義突變位點(diǎn)鑒定研究*

霍建華1，陳姝萍1，盧 群1，張 俊2，白 玲1，馬愛群1，劉 平1Δ

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(西安710061)，2.陜西省鎮(zhèn)安縣中醫(yī)院內(nèi)二科(鎮(zhèn)安711500)

目的：研究中國人冠狀動脈痙攣患者一氧化氮合酶(NOS3)基因突變位點(diǎn)。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)對9例冠狀動脈痙攣的患者NOS3基因全部27個外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序。結(jié)果：冠狀動脈痙攣組中共有4例存在NOS3基因同一位點(diǎn)的同義突變，位于第17外顯子的第1998核苷酸位點(diǎn)處的C突變?yōu)镚(C1998G)，使第666位的密碼子GCC變?yōu)镚CG，所編碼的氨基酸并未發(fā)生改變，仍為丙氨酸(A)，其中3例為雜合子(C/G)，1例為純合子(G/G)，其余患者及健康人群組均未發(fā)現(xiàn)上述突變及已知突變。結(jié)論：冠狀動脈痙攣患者中發(fā)現(xiàn)的NOS3基因同義突變位點(diǎn)(C1998G)可能與冠狀動脈痙攣的發(fā)病相關(guān)。

冠狀動脈痙攣(Coronary artery spasm,CAS)是指由于各種原因?qū)е鹿跔顒用}收縮，引起血管管腔暫時性不完全或完全閉塞，從而引起心肌缺血，產(chǎn)生心絞痛、心律失常、心肌梗死甚至猝死等的臨床綜合征。冠狀動脈痙攣的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前主要發(fā)現(xiàn)它可能與血管內(nèi)皮功能紊亂、血管活性物質(zhì)平衡失調(diào)、血管平滑肌反應(yīng)性增強(qiáng)、植物神經(jīng)功能紊亂、氧化應(yīng)激、慢性炎癥反應(yīng)、心理應(yīng)激、行為方式及Mg2+或H+缺乏等因素有關(guān)，其確切機(jī)制仍然不明確[1]。

目前發(fā)現(xiàn)分子遺傳學(xué)在冠狀動脈痙攣中發(fā)揮作用，已有多項(xiàng)研究結(jié)果表明，基因突變可能參與了冠狀動脈痙攣的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮(NO)合成的減少在冠脈痙攣中起關(guān)鍵作用[2]。因此，NO在合成過程中的一些重要蛋白相關(guān)的基因存在突變等異常，導(dǎo)致其表達(dá)血管活性物質(zhì)的水平改變，最終成為冠狀動脈痙攣發(fā)生的病理生理機(jī)制之一。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)是冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞合成NO過程中的關(guān)鍵酶。一氧化氮合酶(NOS3)基因編碼eNOS，位于常染色體7q35-36，由27個外顯子及26個內(nèi)含子組成，啟動子存在于5’側(cè)翼區(qū)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NOS3突變Glu298Asp和單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)T786C與冠脈痙攣及其它心血管疾病具有相關(guān)性[3-4]。突變可引起eNOS結(jié)構(gòu)的改變，從而使eNOS功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致NO合成與釋放的含量減少，從而增加冠狀動脈痙攣的發(fā)生。本研究旨在對發(fā)生冠脈痙攣的患者進(jìn)行NOS3基因進(jìn)行檢測，以期發(fā)現(xiàn)是否有新的突變位點(diǎn)。

對象和方法

1 研究對象 選取2013年1月至2013年12月期間在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科收治住院診斷為冠狀動脈痙攣的患者9例(研究組)以及健康體檢人群10例(對照組)。研究組入選標(biāo)準(zhǔn)：①臨床上具有靜息性胸悶或胸痛等癥狀特點(diǎn)；②癥狀發(fā)作時伴有心電圖缺血改變，癥狀緩解后心電圖隨之恢復(fù)正常；③冠狀動脈造影未見嚴(yán)重血管狹窄(<50%)或存在>50%狹窄但非罪犯血管。對照組：無任何胸悶、胸痛等癥狀，無高血壓、糖尿病、冠心病等疾病史，年齡和性別構(gòu)成與研究組基本匹配。

2 方 法

2.1 血標(biāo)本的收集及處理及DNA提取：標(biāo)本采自外周靜脈血。每人采集約10ml，經(jīng)EDTA抗凝后，-20℃保存。全血DNA提?。喊凑誘IANGEN生化科技(北京)有限公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒說明進(jìn)行全血DNA提取。

2.2 PCR擴(kuò)增:引物設(shè)計合成：通過NCBI Genebank查找h-NOS3基因的cDNA全序列，按照引物設(shè)計的原則，覆蓋基因外顯子及內(nèi)含子-外顯子交界區(qū)，將h-NOS3基因的27個外顯子分為12個片段，將h-EDN1基因的5個外顯子分為4個片段，分別設(shè)計每個片段的上游及下游引物；引物的合成由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

2.3 PCR反應(yīng)體系：以人基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為50μl，各組分為：模板DNA 4μl，一對引物各2μl，2×Taq PCR MasterMix為25μl，ddH2O為17μl。

2.4 PCR反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置：94℃預(yù)變性3 min后，94℃變性30 s，50～60℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后72℃續(xù)延伸5 min。

2.5 瓊脂糖凝膠電泳及攝影：分別取PCR產(chǎn)物各10μl，與2μl Loading Buffer混合后，加入瓊脂糖凝膠的加樣孔進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后利用高靈敏度化學(xué)發(fā)光儀ChemiDoc XRS(美國BIO-RAD公司)進(jìn)行攝影。

2.6 DNA測序及結(jié)果分析：將瓊脂糖凝膠電泳得到目的條帶的剩余PCR產(chǎn)物(每個片段40 μl)，純化后進(jìn)行直接DNA測序(純化和測序工作由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成)。所得測序結(jié)果通過應(yīng)用NCBI網(wǎng)站GenBank中BLAST程序與NOS3基因的cDNA全序列進(jìn)行比對分析以確定突變位點(diǎn)。

結(jié) 果

冠脈痙攣患者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳攝影照片顯示各外顯子條帶清晰，第17號外顯子所處條帶大小為為985bp(圖1)?；驒z測結(jié)果提示兩組均未發(fā)現(xiàn)Glu298Asp和T786C突變。但研究組中共有4例測序結(jié)果中存在同一位點(diǎn)的同義突變(C1998G)，該突變位于NOS3基因外顯子第1998核苷酸位點(diǎn)處的C突變?yōu)镚，該突變點(diǎn)處于第17號外顯子，使第666位的密碼子GCC變?yōu)镚CG，所編碼的氨基酸并未發(fā)生改變，仍為丙氨酸(A)。根據(jù)峰圖可得到其中3例突變?yōu)殡s合子(C/G)(圖2a)，1例突變?yōu)榧兒献?G/G)(圖2b)。而對照組未發(fā)現(xiàn)突變(圖2c)。

左側(cè)箭頭所指為DNA Ladder圖像，上方箭頭所指為第17外顯子所在的片段圖像，該片段大小為985bp

討 論

eNOS是NO合成過程中的關(guān)鍵酶，因此當(dāng)eNOS結(jié)構(gòu)或功能受損時，則會影響NO的釋放以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，從而增加冠狀動脈痙攣的發(fā)生風(fēng)險。當(dāng)eNOS基因即NOS3基因發(fā)生突變時，則可能改變cDNA的堿基組成，進(jìn)一步使mRNA翻譯后得到的蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸順序或組成發(fā)生改變，從而影響所表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物功能，主要包括同義突變、錯義突變、無義突變等幾種類型?；蛲蛔兛赡芡ㄟ^以上機(jī)制而使eNOS的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生異常，參與冠狀動脈痙攣的發(fā)生。

本研究對NOS3基因共27個外顯子基因篩查發(fā)現(xiàn)，在研究組冠狀動脈痙攣患者中共有4例測序結(jié)果中存在同一位點(diǎn)的同義突變，即位于NOS3基因第17號外顯子的第1998核苷酸位點(diǎn)處的C突變?yōu)镚(C1998G)，使第666位的密碼子GCC變?yōu)镚CG，所編碼的氨基酸并未發(fā)生改變，仍為丙氨酸(A)。其中3例突變?yōu)殡s合子(C/G)，1例突變?yōu)榧兒献?G/G)，提示C1998G突變可能與冠狀動脈痙攣的發(fā)病相關(guān)。

A：突變DNA正向測序峰圖(雜合子)；B：突變DNA正向測序峰圖(純合子)；C：健康患者DNA正向測序峰圖(所指為突變點(diǎn)C→G；所指為突變位點(diǎn)對應(yīng)的氨基酸仍為丙氨酸)

圖2 突變DNA與正常DNA正向測序峰圖

C1998G突變屬于堿基置換突變，該突變對表達(dá)得到的多肽鏈中氨基酸序列的影響類型屬于同義突變。同義突變(Synonymous mutation)是指當(dāng)發(fā)生堿基置換之后，雖然產(chǎn)生了新的密碼子，但是由于生物遺傳密碼子的簡并性，使改變前、后的密碼子屬于同義密碼子，所編碼的氨基酸種類保持不變。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為因?yàn)橥x突變并沒有改變氨基酸的順序或組成，所以不會影響所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能，因此不會產(chǎn)生突變效應(yīng)而成為致病因素，而被稱為沉默突變(Silent mutation)。近年來，隨著越來越多的針對基因調(diào)控區(qū)、內(nèi)含子等翻譯區(qū)突變的研究，同義突變不會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能這個傳統(tǒng)觀念已經(jīng)逐漸轉(zhuǎn)變。雖然同義突變不會引起氨基酸的一級結(jié)構(gòu)，即氨基酸的種類或順序，但在mRNA翻譯合成蛋白質(zhì)的過程中，由于每種密碼子使用的tRNA不同，而細(xì)胞內(nèi)各種tRNA的含量是不相同的，進(jìn)而影響到核糖體的工作效率，使同一種氨基酸對各個簡并密碼子的翻譯效率產(chǎn)生差異，或轉(zhuǎn)錄的水平不完全相同，從而可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變[5]。另外，同義突變可以通過改變mRNA的構(gòu)象，從而降低mRNA的穩(wěn)定性及核糖體的翻譯效率，或者通過減慢密碼子翻譯氨基酸序列的速度，而影響多肽鏈的三維折疊及修飾加工的過程，最終可能使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能[6]。所以C1998G突變可能與冠狀動脈痙攣的發(fā)病關(guān)系密切。

[1] 霍 旺,李紹旦,王 朋,等. 冠狀動脈痙攣機(jī)制研究概況[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,(2): 183-185.

[2] Vecoli C. Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms in cardiovascular disease[J]. Vitam Horm,2014,96: 387-406.

[3] Zhang C,Lopez-Ridaura R,Hunter DJ,etal. Common variants of the endothelial nitric oxide synthase gene and the risk of coronary heart disease among U.S. diabetic men[J]. Diabetes,2006,55 (7): 2140-2147.

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[5] Moura GR,Pinheiro M,Freitas A,etal. Species-specific codon context rules unveil non-neutrality effects of synonymous mutations[J]. PLoS One,2011,6(10):e26817.

[6] Rudolph KL,Schmitt BM,Villar D,etal. Codon-driven translational efficiency is stable across diverse mammalian cell states[J]. PLoS Genet,2016,12(5): e1006024.

MutationsofNOS3geneincoronaryarteryspasm

Huo Jianhua,Chen Shuping,Lu Qun,et al.

Department of Cardiovascular Medicine, the First Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Objective: To study the mutation of NOS3 gene among the patients with coronary artery spasm. Methods: 9 coronary artery spasm patients and 10 healthy control were included in the present study. Peripheral blood was sampled and genomic DNA was extracted,polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing was used to screen all the 27 exons of NOS3 gene. Results: A novel synonymous mutation was found in the NOS3 gene of 4 patients,which was located in the 1998 site of the 17thexon (C1998G). 3 of them were C/G heterozygous mutation and 1 of them was G/G homozygous mutation. Conclusions: A novel synonymous mutation (C1998G) is found in the NOS3 gene of 4 patients,which may be correlated with coronary artery spasm.

Coronary vasospasm/physiopathology Nitric oxide synthase typeⅢ/analysis Mutation

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30801133)

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項(xiàng)目(2014JM2-8154)

△通訊作者

冠狀血管痙攣/病理生理學(xué) 一氧化氮合酶Ⅲ型/分析 突變

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.003

(收稿：2017-04-17)