孟 瑋,史曉宇，孫守燕，張 敬，宗治國，王世旭，馬 峰，趙峻峰

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(張家口 075000),2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科(張家口 075000)

STK15 mRNA、STAT3-siRNA對胃癌細(xì)胞株表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究*

孟 瑋1,史曉宇1，孫守燕1，張 敬1，宗治國2，王世旭1，馬 峰1，趙峻峰1

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(張家口 075000),2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科(張家口 075000)

目的：研究中心體擴(kuò)增激酶STK15以及信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)小干擾RNA(siRNA)在胃癌中的表達(dá)。方法：采用Real-time熒光定量PCR 技術(shù)對7例胃癌新鮮組織和2例正常胃粘膜組織中STK15的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行檢測。采用體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以及荷瘤裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評價(jià)STAT3-siRNA的體內(nèi)外抗腫瘤效果。結(jié)果：STK15 在胃癌組織的表達(dá)量明顯高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。另外，STAT3-siRNA能夠顯著降低胃癌細(xì)胞的體外增殖能力。結(jié)論：中心體擴(kuò)增是細(xì)胞癌變過程的重要事件，中心體的異常擴(kuò)增是細(xì)胞惡性克隆的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。STAT3-siRNA顯著降低胃癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖能力和克隆形成能力。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌(Gastric cancer)的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的異常增殖關(guān)系密切，其中，絲氨酸/蘇氨酸激酶15(Serine/threonine kin se 15 gene，STKl5)的擴(kuò)增和過表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[1-3]。此外，人類STAT3基因也與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。STAT3基因位于第17號染色體(q21.31)。它的高度激活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的信號傳遞作用[4-6]。其機(jī)制可能與STAT3關(guān)閉正常細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子——轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。本研究旨在采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測胃癌組織和正常胃粘膜組織中STK15的mRNA表達(dá)水平，探討其在在胃癌演變過程中的作用及相關(guān)分子機(jī)制，為胃癌的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。另外，本研究還利用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)[7]研究了STAT3基因?qū)τ谖赴┘?xì)胞的體外增殖和克隆形成能力的影響，為胃癌的基因治療提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 隨機(jī)選擇2015年1月至2016年1月在我院消化內(nèi)科行胃鏡活檢的胃癌患者7例(男性4例，女性3例，年齡45.6±10.7歲)和正常胃粘膜患者2例(男性1例，女性1例，年齡45.7±11.5歲)。按2004年WHO病理組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，胃癌標(biāo)本7例和正常胃黏膜組織2例。標(biāo)本均經(jīng)HE染色并經(jīng)病理醫(yī)師再次診斷。

2 主要試劑及儀器 人類胃癌細(xì)胞系MKN-45和SNU-5購買自ATCC；TRIzolRNA提取試劑盒、DNA Mrker(D2000)和2×TqPCR：天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)、PltinumSYBR Green Qpcr Super Mix-UDG和引物：美國Invitrogen公司；瓊脂糖、溴化乙錠、焦碳酸二乙酯：美國Sigm公司；核酸含量測量儀(BioTek)：美國Gene Compny Limited公司；ABI7500型熒光定量PCR擴(kuò)增儀、Micro Amp Opticl96-Well Rection Pltewith Brcode、Micro Ampopticl dhesivefilm：美國ABI公司；凝膠成像分析系統(tǒng)：Biord公司；低溫冷凍離心機(jī)(3K15)：美國Sigm公司；PCR擴(kuò)增儀：英國TECHNE公司。

3 RT-PCR

3.1 cDNA制備和引物設(shè)計(jì)：按照Trizol試劑盒使用說明書提取胃組織總RNA。用核酸測定儀測量定量RNA的濃度及純度，采用瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的完整性。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，4℃保存。STK15引物跨第六內(nèi)含子，MCM5引物跨第五內(nèi)含子，β-ctin引物跨第三和第四內(nèi)含子，作為PCR內(nèi)參照。STK15上游引物5′-TGGAATATGCACCACTTGGA-3′，下游引物5′-ACTGACCACCCAAAATCTGC-3′，擴(kuò)增片段208bp；β-ctin上游引物5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游引物5′-AGTACTTGCGCTCAGGAGGAC-3′，擴(kuò)增片段300bp。

3.2 Rel-timePCR檢測mRNA表達(dá)量：采用20μl反應(yīng)體系，每孔依次加入cDNA2μl，2×mix10μl，上下游引物各0．8μl，Rox0．4μl，無酶水6μl，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30s；95℃，3s；60℃，30s，40個(gè)循環(huán)。目標(biāo)基因的CT值通過β-ctin的CT值均一化，即ΔCT=CT目標(biāo)-CTβ-ctin，而目標(biāo)基因mRNA相對豐度值以ΔΔCT值(DDvlue)表示，ΔΔCT=2-ΔCT。

4 STAT3-siRNA質(zhì)粒的構(gòu)建 DNA序列的5'端和3'端分別有BbsI與BmHI酶切位點(diǎn)，5'端的21nt編碼siRNA正義鏈即靶序列，中間9nt轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，3'端的21nt與5'端19nt反向重復(fù)，編碼siRNA反義鏈，3’端TTTTTT為轉(zhuǎn)錄終止信號。設(shè)計(jì)時(shí)，shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的5’端添加了CACC，與BbsI酶切后形成的粘端互補(bǔ)；反義鏈模板的5’端添加了GATC，與BmHI酶切后形成的粘端互補(bǔ)；如果siRNA的第一個(gè)堿基不是G，則在CACC后補(bǔ)加一個(gè)G。設(shè)計(jì)的siRNA分別是：STAT3-siRNA1，STAT3-siRNA2，和陰性對照Con-siRNA，及陽性對照GAPDH。

5 STAT3-siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長狀態(tài)良好的靶細(xì)胞MKN-45和SNU-5用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液(不含雙抗)吹打成單細(xì)胞懸液，接種于24孔板，待細(xì)胞長至70%～80%密度；用無血清無雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液漂洗待轉(zhuǎn)染細(xì)胞2次；配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物：在50μl的Opti-MEM液體中分別加入反義載體質(zhì)粒STAT3-siRNA1，STAT3-siRNA2及其陰性對照組質(zhì)粒Con-siRNA和陽性對照質(zhì)粒GAPDH各0.8μg。再在50μl的Opti-MEM中加入脂質(zhì)體LipofectmineTM20001.5μl，用移液器輕柔吹吸，室溫下放置5min；將DNA與脂質(zhì)體充分輕柔混勻，室溫放置20min；將復(fù)合物沿培養(yǎng)皿側(cè)壁小心加至GH3細(xì)胞中，加500μl無血清高糖DMED培養(yǎng)液5hr。5hr后，更換培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48～72hr。

6 MTT法檢測STAT3-siRNA對于胃癌細(xì)胞體外增殖的影響 取處于對數(shù)生長期的GH3細(xì)胞常規(guī)消化、離心、重懸，制備成為單細(xì)胞懸液。按5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。置于37°C和5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。次日，吸去孔中培養(yǎng)基，加入200μl無血清培養(yǎng)基，并感染一定量的腺病毒。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)72h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h后，吸去上清并加入150μl DMSO溶液，避光震蕩10 min。將96孔培養(yǎng)板置入酶標(biāo)儀中，檢測各孔在490nm波長處的吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率(%)=藥物組OD值/對照組OD值×100%。

7 克隆形成試驗(yàn)檢測STAT3-siRNA對于胃癌細(xì)胞體外克隆形成能力的影響 取處于對數(shù)生長期的GH3細(xì)胞常規(guī)消化、離心、重懸，制備成單細(xì)胞懸液。按1×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C和5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。每3天換液一次。吸去孔中培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min后，采用0.1%的結(jié)晶紫染色5 min。去離子水漂洗后，數(shù)碼相機(jī)拍照記錄，采用Quntity One(Bio-Rd)對細(xì)胞克隆進(jìn)行定量，克隆形成率(%)=藥物處理組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)×100%。

結(jié) 果

1 STK15在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織 對7例胃鏡活檢的胃癌新鮮組織及2例正常胃黏膜組織從mRNA水平檢測的表達(dá)情況，結(jié)果提示在mRNA水平，STK15在胃癌組織中的表達(dá)都明顯高于胃黏膜正常組織，見圖1。

N:正常胃黏膜組織；T:胃癌組織；*P<0.05

2 成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA載體的胃癌細(xì)胞系 本研究成功構(gòu)建了STAT3-siRNA1、STAT3-siRNA2。將STAT3-siRNA1、STAT3-siRNA2和Con-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌MKN-45和SNU-5細(xì)胞系，利用G418進(jìn)行陽性克隆篩選，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系6株，分別命名為MKN-45/siRNA1、MKN-45/siRNA2、MKN-45/control、SNU-5/siRNA1、SNU-5/siRNA2和SNU-5/control。提取細(xì)胞蛋白總RNA，RT-PCR技術(shù)檢測6株細(xì)胞系中STAT3的表達(dá)水平，顯示與親本細(xì)胞及轉(zhuǎn)染Con-siRNA的細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)染STAT3-siRNA1、STAT3-siRNA2的細(xì)胞中STAT3的表達(dá)水平均有下降，其中以轉(zhuǎn)染STAT3-siRNA1的細(xì)胞下降尤為明顯(圖2)。

圖2 RT-PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各載體的胃癌細(xì)胞系內(nèi)STAT3表達(dá)情況

3 下調(diào)STAT3的表達(dá)顯著降低胃癌細(xì)胞的體外增殖能力 下調(diào)STAT3的表達(dá)，可使胃癌細(xì)胞MKN-45和SNU-5的增殖能力下降，與親本細(xì)胞相比， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

4 下調(diào)STAT3的表達(dá)對胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響 與轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞系相比，轉(zhuǎn)染小干擾RNA的兩種細(xì)胞其克隆形成數(shù)明顯下降(圖4)，提示下調(diào)STAT3的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的克隆形成能力。

圖3 下調(diào)STAT3的表達(dá)對胃癌細(xì)胞系MKN-45和SNU-5增殖能力的影響

與對照細(xì)胞相比，*P<0.05

圖4 下調(diào)STAT3的表達(dá)對胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

討 論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的過程，涉及到癌基因、抑癌基因表達(dá)的失調(diào)，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞凋亡和增殖失平衡、細(xì)胞運(yùn)動和遷移調(diào)控的異常多方面機(jī)制[8-9]。在正常細(xì)胞的有絲分裂過程中，細(xì)胞完成DNA的復(fù)制后，下一步需要進(jìn)行染色體的分離。而染色體分離的異常被認(rèn)為是惡性腫瘤細(xì)胞的具有特征性的標(biāo)志之一。惡性腫瘤細(xì)胞的染色體分離異常的具體機(jī)制尚不完全明確。但是，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細(xì)胞中的中心體的異?？赡軈⑴c了染色體分離異常[10-11]。絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STKl5)的蛋白定位于細(xì)胞中心體，被認(rèn)為是細(xì)胞中心體擴(kuò)增過程中的關(guān)鍵激酶之一[12]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，STK15在多種惡性腫瘤細(xì)胞中都存在著表達(dá)升高的現(xiàn)象，其發(fā)生機(jī)制可能是過表達(dá)的STK15導(dǎo)致中心體數(shù)目增多、多極紡錘絲形成，出現(xiàn)染色體分離的異常和非整倍體增加，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。在實(shí)驗(yàn)中觀察到,從腫瘤中獲取的STK15能激發(fā)機(jī)體對腫瘤的特異性免疫反應(yīng),而正常組織中 的STK15卻無此功能。 90 年代初研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的STK15能夠結(jié)合多肽形成復(fù)合物,如果將這些多肽從該復(fù)合物中去除,剩下的STK15則失去免疫原性。 大量研究表明,腫瘤組織中的STK15分子是與多肽連接在一起的STK15-肽復(fù)合物,與STK15相連接的肽具有免疫原性。STK15-肽復(fù)合物具有免疫原性,能夠激發(fā)腫瘤組織中的抗腫瘤免疫反應(yīng)。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí),STK15可與抗原 肽結(jié)合。 隨后STK15-抗原肽復(fù)合物在一個(gè)受體介導(dǎo)的作用下 將抗原肽傳遞給巨噬細(xì)胞或其他抗原遞呈細(xì)胞(APC),經(jīng)抗原遞呈途徑,抗原肽被遞呈給主要組織相容復(fù)合物I(MHCI)類分子,進(jìn)而激活特異性CTL和CD8+T細(xì)胞,引起機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

本研究采用Rel-time熒光定量PCR技術(shù)比較了胃癌組織和正常胃黏膜中STK15基因mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：STK15基因mRNA在胃癌組織的表達(dá)水平明顯高于正常組織，提示STK15可能是胃癌的特異性生物標(biāo)志物，從而為胃癌的早期診斷和治療提供了一定的理論依據(jù)。

人類STAT3基因位于第17號染色體(q21．31)，高度激活的STAT3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中起著重要的信號傳遞作用[14]。研究還發(fā)現(xiàn)，STAT3在耐藥的胃癌細(xì)胞中也是過度表達(dá)的，使許多腫瘤細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抑制作用，在臨床上展現(xiàn)出對化療藥物的不敏感性[15]。多種研究表明 STAT3是EGFR、IL-6 / JAK、Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號通道的匯聚 的焦點(diǎn),在多種腫瘤細(xì)胞和組織中都有激活,如卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、非小細(xì)胞性肺癌和各種白血病等。但是，關(guān)于STAT3基因?qū)τ谖赴┘?xì)胞的體外增殖能力和克隆形成能力的研究尚未見報(bào)道。本研究采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)下調(diào)STAT3基因，然后觀察胃癌細(xì)胞的體外增殖和克隆形成能力的變化。本研究結(jié)果提示，下調(diào)STAT3的表達(dá)能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞的體外增殖和克隆形成能力，這為胃癌的基因治療提供了一定的理論依據(jù)。

綜上所述，中心體擴(kuò)增是細(xì)胞癌變過程的重要事件，中心體的異常擴(kuò)增是細(xì)胞惡性克隆的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。STAT3-siRNA顯著降低胃癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖能力和克隆形成能力。

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ExpressionofSTK15mRNAandSTAT3 -siRNAingastriccarcinomacellline

Meng Wei,Shi Xiaoyu,Sun Shouyan,et al.Department of Medical Oncology,

the First Affiliated Hospital of Hebei North University(Zhangjiakou 075000)

Objective: To study the expression of centrosome amplification kinase STK15and transcription factor 3 (STAT3) small interfering RNA (siRNA) in gastric carcinoma. Methods: The expression of STK15 mRNA in gastric tissue was detected by Real-time fluorescence quantitative PCR. In vitro and in vivo antitumor effects of STAT3-siRNA were evaluated by in vitro transfection experiments and tumor-bearing nude mice. Results: The expression of STK15 in gastric cancer was 1.326 ± 0.072,0.655 ± 0.053 in normal gastric tissue,the difference was significant (P<0.01). STAT3-siRNA significantly reduced the ability of gastric cancer cells to proliferate and clone formation ability in vitro. Conclusion: Central body amplification is an important event in the process of cell carcinogenesis. Abnormal amplification of central body is the key link of malignant cell cloning. STAT3-siRNA significantly reduced the ability of gastric cancer cells in vitro and in vivo and tumorigenic ability. Which may play a role by inhibiting the expression of PCNA.

Stomach neoplasms/pathology @Serine/threonine kinse 15 gene Activating transcription factor 3/analysis Gene amplification Centrosome

*河北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20160361)

胃腫瘤/病理學(xué) 轉(zhuǎn)錄激活因子3/分析 @絲氨酸/蘇氨酸激酶15 基因擴(kuò)增 中心體

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.002

(收稿：2017-05-04)