田冰玉 ,白淑瑋，康前雁

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科(西安 710061)，2.西安市第四醫(yī)院眼科(西安710004)

·基礎(chǔ)研究·

microRNA -125b對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖和凋亡作用實(shí)驗(yàn)研究*

田冰玉1,2,白淑瑋2，康前雁1△

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科(西安 710061)，2.西安市第四醫(yī)院眼科(西安710004)

目的:探討microRNA -125b(miR -125b)在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)，及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。方法：采用RT-PCR方法檢測(cè)miR -125b在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Y79中的表達(dá)；構(gòu)建miR-125b過表達(dá)(miR-125bmimic)和抑制載體(miR-125inhibitor)轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞，檢測(cè)miR-125b表達(dá)情況；通過細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8)觀察miR-125b過表達(dá)和抑制表達(dá)后，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖力和凋亡的影響。結(jié)果：miR-125b在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中Y79細(xì)胞系中呈高表達(dá)；miR-125bmimic組(Y79+miR-125bmimic)中miR-125b的表達(dá)較miR-NC組(未處理的Y79細(xì)胞)表達(dá)顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); miR-125binhibitor組(Y79+miR-125binhibitor)中miR-125b的表達(dá)較miR-NC組表達(dá)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-125bmimic組較miR-NC組相比,Y79細(xì)胞增殖力顯著增高，細(xì)胞凋亡顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而miR-125inhibitor組較miR-NC組相比腫瘤細(xì)胞增殖力顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-125b可能是通過DRAM2基因來發(fā)揮其致癌作用；結(jié)論：miR-125b 可能作為癌基因在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中發(fā)揮作用，并對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡具有顯著影響。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Retinoblastoma，RB)是人視網(wǎng)膜最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤,多發(fā)病于嬰幼兒，在世界范圍內(nèi)，發(fā)病率為每1/15000～1/20000,每年的新增病例為9000例[1]。眼球摘除一直是RB患兒較為普遍的治療手段，現(xiàn)國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者致力于研究保留RB患兒的眼球及有用視力，提高患兒的生活質(zhì)量。現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，microRNA廣泛參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[2]。很多研究報(bào)道指出miR -125b參與了多種腫瘤的增殖和侵襲[3]。本研究目的為探討miR -125b對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，尋求RB治療新的分子靶點(diǎn)。

材料和方法

1 材 料 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞，培養(yǎng)液采用含10%胎牛血清+RPMI 1640 培養(yǎng)液 ,在37 ℃、含5%的CO2飽和濕度下培養(yǎng)，Y79腫瘤細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Y79細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方 法

2.1 RNA的提?。菏褂?Trizol 試劑盒提取細(xì)胞總 RNA(miR-125b引物序列， 5’-GUAAUGAUUAUGAUUCUCAGGGA-3’)，莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 miRNA 第 1 鏈 cDNA，進(jìn)行 SYBR GREEN PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94 ℃ 變性20 s; 94 ℃，30 s; 60 ℃，45 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

2.2 腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ：轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000(Life Technologies)，轉(zhuǎn)染按照說明書進(jìn)行，構(gòu)建miR-125b過表達(dá)和抑制載體(由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成),分為四組：未處理的Y79細(xì)胞(miR-NC組)，Y79細(xì)胞+ miR-125bmimic(miR-125bmimic組)，Y79細(xì)胞+ miR陰性對(duì)照組(anti-miR)，Y79細(xì)胞+ miR-125inhibitor(miR-125inhibitor組)-。

2.3 CCk-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率：收集上述四組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，上述四組實(shí)驗(yàn)組每孔加入90μl，細(xì)胞密度約5×103個(gè)接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組3個(gè)孔，空白對(duì)照加入100μl 培養(yǎng)液，每孔加入10μl CCK-8 試劑，再孵育2h，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度值(450nm 波長(zhǎng))。按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)= [(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100%，其中實(shí)驗(yàn)孔(miR-125bmimic/anti-miR/miR-125inhibitor+CCK-8 ；對(duì)照孔(miR-NC+CCK-8)；空白孔(培養(yǎng)基+CCK-8)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：收集上述四組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，細(xì)胞密度達(dá)1×106/ml，取100μl細(xì)胞懸液放入1.5ml離心管中，按照檢測(cè)凋亡試劑盒(Annexin V-FITC ，BD Pharmingen)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 蛋白檢測(cè):收集以上四組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，細(xì)胞總蛋白的提取，應(yīng)用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。每組取30μg蛋白樣本，進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)移蛋白島硝酸纖維膜，封閉液封閉后，進(jìn)行免疫雜交，加入稀釋的一抗兔抗人DRAM2多克隆抗人(Santacruz公司)，4℃過夜后，TBS液清洗，而后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG二抗(Santacruz公司)1h后，顯色、曝光、顯影，其中β-action為內(nèi)參。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-125b在Y79細(xì)胞中的表達(dá) Y79細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)相比， miR-125b表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2 Y79細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后miR-125b的表達(dá) miR-NC和anti-miR組miR-125b的表達(dá)量相當(dāng)，差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-125bmimic組較miR-NC和anti-miR組miR-125b的表達(dá)量顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；miR-125binhibitor組較miR-NC和anti-miR組miR-125b的表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

3 轉(zhuǎn)染后Y79細(xì)胞增殖能力的變化 miR-125bmimic組較miR-NC和anti-miR組相比，Y79細(xì)胞增殖力顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-125binhibitor組較miR-NC和anti-miR組相比，腫瘤細(xì)胞增殖力顯著性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖1 miR-125b在Y79細(xì)胞系中呈高表達(dá)

圖2 miR-125b在miR-125bmimic組和miR-125binhibitor組中表達(dá)

圖3 miR-125bmimic組和miR-125binhibitor組腫瘤細(xì)胞增殖力

4 轉(zhuǎn)染后Y79細(xì)胞凋亡率的變化 miR-125bmimic組較miR-NC和anti-miR組相比，腫瘤細(xì)胞凋亡率下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-125binhibitor組較miR-NC和anti-miR組相比，Y79 才細(xì)胞凋亡率顯著性增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

5 miR-125b與靶基因 DRAM2的功能驗(yàn)證 采用Westernblot檢測(cè)miR-NC，miR-125bmimic，anti-miR，miR-125binhibitor四組的靶基因DRAM2蛋白表達(dá)量變化。miR-125bmimic組靶基DRAM2表達(dá)量下降，miR-125binhibitor組靶基因DRAM2表達(dá)量增多，miR-NC，anti-miR組靶基因DRAM2表達(dá)量介于上述兩組之間(圖5)。

圖4 四組凋亡實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞分布(A)，及量化后各組細(xì)胞凋亡比例(B)

討 論

由于我國(guó)醫(yī)療水平地區(qū)差異，醫(yī)療資源分配不平衡，使得視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)診斷滯后，很多患兒就醫(yī)時(shí)不得不行眼球摘除治療。本研究為尋求RB治療新的分子靶點(diǎn)，鑒于miR -125b在很多腫瘤中所發(fā)揮的作用為研究背景，探討其在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)，及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。

microRNA是近年來生命科學(xué)新的研究熱點(diǎn)之一,其介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤血管生成、干細(xì)胞分化、腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等一系列的生命活動(dòng)。microRNA具備了穩(wěn)定性好，通過采血即可獲得，可作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤篩查和診斷的手段之一，還可通過測(cè)定其表達(dá)量，來評(píng)估視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療效果。近幾年來，腫瘤相關(guān)microRNA 研究層出不窮，證實(shí)了很多與腫瘤發(fā)生發(fā)展、診斷以及預(yù)后等具有相關(guān)性的microRNA分子[2]。

miR-125b在不同的腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起到了不同作用，有研究指出，miR-125b分子的異常表達(dá)在不同腫瘤中的作用不盡相同[3]。Scott GK研究指出在乳腺癌中，MiR-125b分子的表達(dá)降低，MiR-125表達(dá)增多明顯抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖力[4]；而Shi XB在前列腺癌研究中得出，MiR-125b高表達(dá) 可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[5];進(jìn)一步得出是通過Bak1分子發(fā)揮作用；肖文峰對(duì)骨肉瘤組織研究發(fā)現(xiàn)microRNA-125b的表達(dá)水平顯著下降,microRNA-125b過表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,且監(jiān)測(cè)microRNA-125b水平有助于診斷骨肉瘤[6]。王丹丹的研究表明，miR-125b的表達(dá)量與肺癌患者化療次數(shù)呈反比，提示了miR-125b可作為腫瘤患者評(píng)價(jià)治療效果的潛在標(biāo)記物[7]。這些研究結(jié)果提示著MiR-125b在不同腫瘤中，表達(dá)趨勢(shì)和作用的不一致性[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究通過miR-125b 的高表達(dá)和抑制表達(dá)得出miR-125b分子可能作為癌基因參與了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展，并且進(jìn)一步指出其可能是通過DRAM2基因來發(fā)揮其致癌作用。DRAM2是DRAM基因(DNA-damageregulatedautophagy modulator)的同源蛋白，DRAM基因是P53介導(dǎo)的細(xì)胞自噬死亡的重要組成成分，是P53誘導(dǎo)細(xì)胞自噬所需的必須蛋白之一，它通過誘導(dǎo)其他自噬蛋白的累積，而達(dá)到細(xì)胞自噬的效果[9]。并且研究指出在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中DRAM2基因表達(dá)下降[10]。推測(cè)DRAM可通過P53介導(dǎo)的細(xì)胞自噬死亡作用，促使腫瘤細(xì)胞死亡。我們的研究指出了在Y79細(xì)胞中miR-125b高表達(dá)，同時(shí)伴有DRAM2基因的表達(dá)下降，進(jìn)一步明確了DRAM2基因在RB中所發(fā)揮的作用。

本研究結(jié)果提示，miR-125b分子的過表達(dá)能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞株的增殖，降低miR-125b分子表達(dá)可以抑制Y79細(xì)胞增殖，并初步得出其可能是通過DRAM2基因來發(fā)揮作用。MiR-125b對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的具體分子機(jī)制和分子靶點(diǎn)還需要進(jìn)一步研究。本文旨在為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的診斷和治療及預(yù)后提供新的思路。

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EffectofmicroRNA-125bonproliferationandapoptosisofhumanretinobcastomacells

Tian Bingyu,Bai Shuwei,Kang Qianyan. Department of Ophthalmology,

The First Affiliate Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Objective ：To evaluate the expression level of microRNA-125b( miR-125b) in retinoblastoma and study its roles in cell proliferation and apoptosis． Methods ：The expression of miR-125b was detected by real-time PCR in retinoblastoma Y79 cell lines．The synthesized miR-125b mimic and miR-125b inhibitor was transfected into retinoblastoma Y79 cell lines．The cell proliferation and apoptosis were measured by CCK-8 and flow cytometry respectively．Results： MiR-125b was significantly up-regulated in retinoblastoma Y79 cell lines .Expression of miR-125b in miR-125bmimic group(Y79 cells+ miR-125bmimic ) was significantly up-regulated compared with miR-NC group(untreated Y79 cells)(P<0.05). It apparently promotes RB cell proliferation and suppresses cell apoptosis in miR-125bmimic group compared with miR-NC group (P<0.05),while it apparently suppresses RB cell proliferation and promotes cell apoptosis in miR-125bmimic group compared with miR-NC group (P<0.05) . the suppressor gene DRAM2 may be identified as direct target of miR-125b.Conclusions ：MiR-125b may act as an oncogene in retinoblastoma through regulation of cell proliferation and apoptosis．

@microRNA-125b Rretinoblastoma/pathology Cell proliferation Apoptosis Oncogenes

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302198)

△通訊作者

@microRNA -125b 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤/病理學(xué) 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 癌基因

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.001

(收稿：2017-05-18)