王佳寧，馬永強(qiáng)，王 鑫，劉曉飛，2，張 宇

藍(lán)靛果鞣花酸超聲波輔助提取工藝的研究

王佳寧1，*馬永強(qiáng)1，王 鑫1，劉曉飛1，2，張 宇1

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

以黑龍江省勃利縣的藍(lán)靛果作為材料，采取超聲波輔助的方法提取藍(lán)靛果中的鞣花酸，并以鞣花酸得率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化最佳提取工藝，確定了最佳的鞣花酸提取條件。結(jié)果表明，藍(lán)靛果中的鞣花酸的最優(yōu)提取條件為料液比1∶33（g∶mL），提取溫度51℃，提取時(shí)間78 min，此時(shí)鞣花酸提取率為18.31%。

藍(lán)靛果；鞣花酸；超聲波輔助法；響應(yīng)曲面法

藍(lán)靛果（Lonicera caerulea L.），屬藍(lán)靛果忍冬的變種。橢圓形漿果味道，酸甜可口、營養(yǎng)豐富，具有較高的藥用價(jià)值和保健功能，有著較大的開發(fā)潛力和廣闊的發(fā)展空間[1-2]。如今，藍(lán)靛果在國外主要分布于俄羅斯、日本及朝鮮北部等地區(qū)，國內(nèi)則主要分布在東北、華北和西北等地，大、小興安嶺和長白山地區(qū)的野生資源貯量最大[3]，常生于高山林下、河岸或者沼澤灌木。

藍(lán)靛果中富含多種氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等物質(zhì)，是一種營養(yǎng)價(jià)值非常高的漿果，并且其果實(shí)中還富含多種生物活性物質(zhì)，如酚酸類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)及花色苷類物質(zhì)等[4]，具有抗氧化功能，可抗腫瘤、抗衰老、預(yù)防心血管疾病、神經(jīng)性等多種慢性疾病[5-7]，具有較高的醫(yī)用價(jià)值；還可以起到提高免疫力和調(diào)節(jié)血脂等作用，具有極高的藥用價(jià)值，這與其含有特定的多酚類化合物有關(guān)。

鞣花酸（Ellagic acid）是一種普遍存在于復(fù)雜的自然界的酚類物質(zhì)，在很多果實(shí)組織中都能找到，是一種天然的多酚二內(nèi)酯。它又被稱為六羥基聯(lián)苯二酸二內(nèi)酯，是一種沒食子酸的二聚衍生物。鞣花酸具有的抗氧化和抗癌等活性，可廣泛應(yīng)用于食品、藥品、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域。另外，還具有凝血、抗細(xì)菌和抗病毒等作用，對人體免疫缺陷病毒也有一定的抑制作用，可抗癌變、抗誘變、抗突變[8]。

目前，鞣花酸常用的提取方法主要有3種，即溶劑浸提法、微波輔助法和超聲波輔助法。其中，溶劑浸提法存在提取率低、提取時(shí)間長等問題；微波輔助法可提高提取效率，但其熱效應(yīng)對熱不穩(wěn)定的物質(zhì)具有破壞作用，從而適得其反，使其提取率降低；超聲波輔助提取技術(shù)是一項(xiàng)現(xiàn)代高新技術(shù)手段，目前多用于天然產(chǎn)物的提取，與傳統(tǒng)提取法相比具有提取時(shí)間短、工作效率高等特點(diǎn)，并且可有效降低溫度對熱不穩(wěn)定物質(zhì)的影響，這與微波輔助法相比，不僅可以提高產(chǎn)物的品質(zhì)和產(chǎn)量[9-13]，還有較廣的應(yīng)用范圍。

基于上述，試驗(yàn)選用黑龍江省勃利縣的藍(lán)靛果作為原料，通過超聲波輔助提取方法對其中的鞣花酸進(jìn)行提取，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面試驗(yàn)選取最優(yōu)方案進(jìn)行工藝優(yōu)化研究，確定最佳的提取工藝條件，旨在完善提取方法、提高提取效率，也為藍(lán)靛果中鞣花酸的開發(fā)和深加工及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)靛果，產(chǎn)自黑龍江省勃利縣。

鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、鹽酸、丙酮、蒸餾水等。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177型中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；FA1104B型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；722型紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；TDL80-2B型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠制造產(chǎn)品。

1.3 材料的預(yù)處理

取速凍藍(lán)靛果鮮果，將其平鋪于干燥盤中，置于恒溫干燥箱中于30℃下干燥24 h，使其失去大部分水分，調(diào)高溫度至40℃，藍(lán)靛果含水量達(dá)到8%，用中草藥粉碎機(jī)打碎，備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.4.1 對照溶液

準(zhǔn)確稱取0.010 0 g鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品，在攪動(dòng)下，緩慢滴加4 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液，待鞣花酸溶解后，用去離子水稀釋，定容至100 mL作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，待用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜特性

準(zhǔn)確吸取1.4.1中的標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，加水稀釋至200 mL，用紫外分光光度計(jì)在室溫下測定吸光度（蒸餾水作參比）。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取1.4.1中的標(biāo)準(zhǔn)溶液1，5，10，15，20 mL于200 mL容量瓶中，加水稀釋，定容至刻度線，配成質(zhì)量濃度為 0.5，2.5，5.0，7.5，10.0 μg/mL對照品稀釋液，并于波長357 nm處測定吸光度值，重復(fù)測定3次，取其平均值。以鞣花酸的質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 鞣花酸得率的測定

利用如下公式計(jì)算鞣花酸得率（P）：

式中：m——提取的鞣花酸總質(zhì)量，mg；

M——樣品總質(zhì)量，mg。

1.6 不同溶劑對鞣花酸提取率的影響

分別稱量3份1.3中經(jīng)預(yù)處理后的樣品粉末1.00 g，并分別置于3個(gè)燒杯中。在溫度60℃，超聲波功率300 W條件下，料液比1∶30（g∶mL） 分別加入等體積的乙醇、丙酮和鹽酸，提取50 min，并在轉(zhuǎn)速4 000 r/min條件下離心10 min；減壓抽濾，獲得澄清液體，分別量取提取液0.5 mL，置于各個(gè)比色管中，加入25 mL丙酮，搖勻，測定其吸光度（357 nm），計(jì)算鞣花酸總質(zhì)量并進(jìn)行比較。

1.7 超聲波輔助法提取鞣花酸工藝研究

根據(jù)1.6中的試驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，明確后續(xù)試驗(yàn)的提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮-水溶液。并進(jìn)一步研究提取溫度、超聲波作用時(shí)間、料液比對超聲波輔助提取藍(lán)靛果中鞣花酸得率的影響，調(diào)節(jié)提取溫度為40，50，60，70，80℃；超聲時(shí)間為20，30，40，50，60 min；料液比為 1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL）。測定其吸光度（357 nm），并計(jì)算藍(lán)靛果中鞣花酸得率。

1.8 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以80%的丙酮-水溶液為提取溶劑，選取料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）3個(gè)因素為自變量，以藍(lán)靛果中鞣花酸得率為響應(yīng)值（Y），根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并通過Design Expert 8.06軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出藍(lán)靛果中鞣花酸提取的最優(yōu)方案。

響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

此標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：

Y=0.054 5X-0.000 9，R2=0.997.

證明該曲線線性關(guān)系良好，在鞣花酸含量為0～12 μg時(shí)呈線性關(guān)系，可用于計(jì)算鞣花酸的含量。

2.2 不同試劑對藍(lán)靛果鞣花酸提取率的影響

不同試劑對藍(lán)靛果鞣花酸提取率的影響見圖2。

圖2 不同試劑對藍(lán)靛果鞣花酸提取率的影響

由圖2可知，不同試劑對藍(lán)靛果中鞣花酸提取率具有顯著（p＜0.05）影響。由試驗(yàn)結(jié)果可看出丙酮提取鞣花酸的提取率較高，用超聲提取法測得的鞣花酸提取率為16.32%，鹽酸的提取效果較弱，為10.31%。通過比較3種提取劑對于藍(lán)靛果中鞣花酸的提取率，即丙酮對于鞣花酸的提取效果最佳。而且相對于其他的溶劑而言，丙酮最不易與水解鞣質(zhì)反應(yīng)。因此選擇丙酮作為溶劑對鞣花酸進(jìn)行提取[14]。

2.3 超聲輔助法單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對藍(lán)靛果提取率影響的結(jié)果

料液比對藍(lán)靛果鞣花酸提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對藍(lán)靛果鞣花酸提取率的影響

由圖3可知，料液比對藍(lán)靛果中鞣花酸提取率具有顯著（p＜0.05） 影響。料液比在1∶20～1∶40，鞣花酸提取率呈上升趨勢，因?yàn)槿軇┹^多，可增加與物料的表面積接觸，加快了目標(biāo)物質(zhì)的溶出。在料液比1∶40之后，鞣花酸提取率呈下降趨勢，由于料液比的增加會(huì)溶解出更多的其他物質(zhì)，這不僅浪費(fèi)有機(jī)試劑還引入了雜質(zhì)[15]。綜合經(jīng)濟(jì)成本及后續(xù)進(jìn)行的濃縮處理等因素的考慮，故可確定料液比單因素的最佳條件為1∶40。因此，選擇料液比1∶30～1∶50，進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。魏征等人[16]的研究結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，利用超聲波提取圓葉葡萄中鞣花酸和總酚的效果最好，此結(jié)論與試驗(yàn)結(jié)果相近。

圖4 超聲波提取溫度對鞣花酸提取率的影響

2.3.2 超聲波提取溫度對藍(lán)靛果鞣花酸提取率的影響超聲波提取溫度對鞣花酸提取率的影響見圖4。由圖4可知，超聲波提取溫度對藍(lán)靛果中鞣花酸提取率具有顯著（p＜0.05）影響。鞣花酸提取率隨著超聲波提取溫度的升高而增加，較高的溫度可以加快藍(lán)靛果中鞣花酸的溶出速率，有利于鞣花酸的浸透、溶解[17]，鞣花酸提取率在50℃時(shí)達(dá)到峰值10.63%。繼續(xù)加熱后提取效果反而下降，這可能是藍(lán)靛果中的鞣花酸的對熱不穩(wěn)定性，當(dāng)提取溫度過高時(shí)，鞣花酸的分子結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致其損失，使得提取率有所降低[19]。鄧小莉等人[18]對石榴皮鞣花酸得率研究的結(jié)果顯示，在超聲波功率200 W，提取時(shí)間30 min的條件下，最適的提取溫度60℃，這與試驗(yàn)趨勢整體相同，結(jié)果接近。

2.3.3 提取時(shí)間對藍(lán)靛果鞣花酸提取率的影響結(jié)果

提取時(shí)間對鞣花酸提取率的影響見圖5。

圖5 提取時(shí)間對鞣花酸提取率的影響

由圖5可知，提取時(shí)間對藍(lán)靛果中鞣花酸提取率具有顯著（p＜0.05） 影響。當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí)，藍(lán)靛果中鞣花酸提取率較低，這是因?yàn)樘崛r(shí)間較短時(shí)，鞣花酸與丙酮水溶液接觸不夠充分。當(dāng)提取時(shí)間增加，藍(lán)靛果中的鞣花酸提取率隨之增加，并在50 min時(shí)提取率達(dá)到最大（11.00%）。隨后，鞣花酸提取率隨提取時(shí)間的增加而下降，可能此時(shí)的藍(lán)靛果鞣花酸因較長時(shí)間暴露在空氣中，部分已氧化分解，使其得率下降。

2.4 超聲波輔助提取鞣花酸的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)模型的建立與分析

響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見表2。

響應(yīng)曲面分析法是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，是從含有多個(gè)影響因素及其交互作用的系統(tǒng)中，尋找最佳方案的統(tǒng)計(jì)方法，最常被使用的是Box-Behnken設(shè)計(jì)[20]。 利用Design Expert 8.06軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合分析，得到藍(lán)靛果中鞣花酸提取率（Y） 對編碼自變量A，B，C的回歸模型方程為：

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

Y=15.76+1.09A+0.89B+0.72C-0.80AB+1.36AC-0.77BC-2.29A2-0.79B20.28C2.

回歸方程方差分析見表3。

由表3可知，回歸模型具有極高顯著性（p＜0.000 1），并且失擬項(xiàng)p=0.972 7＞0.05不顯著。該方程的校正決定系數(shù)（R2Adj）為0.907 4，R2=0.959 5，表明該模型的擬合度較好，試驗(yàn)誤差小。因此，該模型能夠反映響應(yīng)值鞣花酸提取率（Y）的變化，可利用該回歸模型方程對超聲波輔助提取藍(lán)靛果中鞣花酸的工藝條件進(jìn)行預(yù)測和分析。結(jié)合表3中的p值可知，二次項(xiàng)A2對鞣花酸提取率有顯著影響（p＜0.05）；C、AC和B2的p值均小于0.01，故它們對鞣花酸提取率有非常顯著的影響，其他因素影響不顯著。根據(jù)F值進(jìn)一步可知，各個(gè)因素對超聲波輔助提取藍(lán)靛果中的鞣花酸提取率影響順序?yàn)樘崛r(shí)間（C） ＞提取溫度（B） ＞料液比（A）。

表3 回歸方程方差分析

2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化

各因素交互作用對鞣花酸提取率影響的響應(yīng)面和等高線見圖6。

圖6 各因素交互作用對鞣花酸提取率影響的響應(yīng)面和等高線

由圖6可知，變化的響應(yīng)曲面和疏密程度不同的等高線可以直觀地反映超聲波輔助提取試驗(yàn)中的料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C） 之間交互作用對藍(lán)靛果中鞣花酸提取率的影響，若等高線呈近似正圓形時(shí)，則表示兩兩因素交互作用不顯著；若呈橢圓形或馬鞍形時(shí)，則表示兩兩因素交互作用顯著[21-22]。

結(jié)合以上響應(yīng)曲面的分析結(jié)果，使用Design Expert 8進(jìn)行最優(yōu)條件選擇，確定最佳藍(lán)靛果中鞣花酸提取工藝參數(shù)如下：料液比1∶33.8，提取溫度51.1℃，提取時(shí)間53.7min，鞣花酸提取率的預(yù)測值為18.532 9%。為檢查考證試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，采取上述工藝參數(shù)進(jìn)3次重復(fù)性試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)際操作的情況，對最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行以下調(diào)整：料液比1∶33，提取溫度51℃，提取時(shí)間54 min。在此條件下，3次測得的藍(lán)靛果中鞣花酸提取率均值為18.31%，與預(yù)測值差異不顯著，說明建立的回歸方程能真實(shí)準(zhǔn)確地反映上述3個(gè)因素對鞣花酸提取率的影響，證明該工藝條件可行。

3 結(jié)論

超聲波輔助法提取藍(lán)靛果中的鞣花酸具有更加節(jié)省時(shí)間、節(jié)約能源、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。通過單因素考查及Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到藍(lán)靛果中的鞣花酸最優(yōu)提取工藝為料液比1∶33（g/mL），提取溫度51℃，提取時(shí)間54 min，在此條件下對藍(lán)靛果中的鞣花酸進(jìn)行提取，最終提取率為18.31%。

[1]王妙飛，程庚金生，張道英.等.水解法制取五倍子鞣花酸的研究 [J].食品工業(yè)科技，2010，31（2）：233-234.[2]李素琴，袁其朋，徐健梅.鞣花酸的生理功能及工藝開發(fā)研究現(xiàn)狀 [J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13（5）：71-74.

[3]霍俊偉，睢薇，阮瑞雪.黑龍江省野生藍(lán)靛果忍冬染色體的觀察 [J].中國林副特產(chǎn)，2004，8（4）：15-16.

[4]張赟彬，李彩俠，吳亞卿.黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2005，21（5）：70-73.

[5]Jurikova T，Rop O，Mlcek J.Phenolic profile of ediblehoneysuckle berries and their biological effects[J].Molecules，2012，17 （1）：61-79.

[6]Lee J H，Park K H，Lee M H，et al.Identification，characterization，and quantification of phenolic compounds in the antioxidant activitycontatiningfraction from the seeds of Korean Perilla（Perillafrutescens） cultivars[J].Food Chemistry，2013 （3）：843-852.

[7]焦巖，王振宇.藍(lán)靛果花色苷超聲波輔助提取優(yōu)化及其降血脂作用 [J].中國食品學(xué)報(bào)，2010，10（2）：52-59.

[8]齊桂元.長白山野生藍(lán)靛果忍冬的開發(fā)利用 [J].中國野生植物資，1993（2）：27-28.

[9]程秀瑋，魏瑋.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取桑葚花色苷工藝的研究 [J].中國釀造，2014，33（6）：123-127.

[10]PanGuangyan，Yu Guoyang，Zhu Chuanhe，et al.Optimization ofultrasound-assisteddetraction（UAE） of flavonoids compounds（PC） from hawthorn seed（HS） [J].Ultrason Sonochemistry，2012，19 （3）：486-490.

[11]Chemat F， Huma Z， Khan M K.Applications of ultrasoundin food technology：processing，preservation and extraction[J].Ultrasonics Sonochemistry，2011，18 （4）：813-835.

[12]姚瑞祺.植物多酚提取分離方法研究進(jìn)展 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2011（5）：84-85.

[13]溫玲蓉，林戀竹，趙謀明.溪黃草常壓回流提取物與減壓回流提取物抗氧化性的比較 [J].現(xiàn)代食品科技，2010，26 （1）：71-75.

[14]謝陽姣，謝冬養(yǎng)，何志鵬，等.油茶籽餅多酚丙酮提取工藝研究 [J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，43（3）：376-379.

[15]屈政，羅磊，楊彬，等.響應(yīng)面優(yōu)化丙酮粉法提取金銀花多酚氧化酶 [J].生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（7）：201-206.

[16]魏征，趙雅嬌，黃羽，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取圓葉葡萄鞣花酸和總酚工藝 [J].食品科學(xué)，2015，36 （12）：29-35.

[17]王長雷，張文娥，潘學(xué)軍.核桃雄花中總多酚提取工藝的研究 [J].食品工業(yè)，2015（1）：77-81.

[18]鄧小莉，董翠月，吳羽晨，等.不同提取方法對石榴皮鞣花酸提取率的影響 [J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2015（6）：969-973.

[19]鄭菲，黃亮，李安平，等.響應(yīng)面法優(yōu)化橡實(shí)殼中多酚提取工藝條件 [J].食品與機(jī)械，2011，27（1）：49-51.

[20]Sun Yi，Wu Wenqing，Zhang Wenqin，et al.Optimizing theextraction of phenolic antiodants from Kudingcha made from Ilexkudingcha C.J.Tseng by using response surface methodology[J].Separation and Purification Technology，2011（3）：311-320.

[21]陳晨，胡文忠，田沛源，等.超聲輔助提取香蕉皮多酚工藝優(yōu)化及其抗氧化性的分析 [J].食品科學(xué)，2014，35 （2）：12-17.

[22]王海燕，李睿，曾秀，等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取桑葉槲皮素工藝 [J].食品科學(xué)，2014，35（22）：56-62.◇

Study on Ultrasonic-assisted Extraction of Ellagic Acidfrom Lonicera edulis

WANG Jia'ning1，*MA Yongqiang1，WANG Xin1，LIU Xiaofei1，2，ZHANG Yu1
（1.College of Food Engineering Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China；2.Food Processing Institute，Helongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150086，China）

Selected from Heilongjiang Province Boli County of Lonicera edulis as a material.The optimum extraction process was optimized by single factor experiment and response surface method，and the optimum extraction conditions of ellagic acid were determined by ultrasonic assisted method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：the ratio of material to liquid 1∶33（g∶mL），the extraction temperature 51 ℃ and the extraction time 78 min.The yield of ellagic acid was 18.31%.

lonicera caerulea L.；ellagic acid；ultrasonic-assisted method；response surface methodology

TQ914.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.040

1671-9646（2017） 10b-0038-05

2017-08-25

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)設(shè)計(jì)項(xiàng)目（GC13B204）。

王佳寧（1993— ），女，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

*通訊作者：馬永強(qiáng)（1963— ），男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物。