陳敬文，張偉，王天媧，程俊，羅金風(fēng)

（1深圳市人民醫(yī)院病理科，深圳 518020；2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科，廣州 510010）

不同脫鈣條件下三種脫鈣液脫鈣效果的比較

陳敬文1*，張偉2，王天媧1，程俊1，羅金風(fēng)1

（1深圳市人民醫(yī)院病理科，深圳 518020；2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科，廣州 510010）

目的探討在常溫和加溫脫鈣條件下，甲酸混合液、Alexander硝酸甲醛液及Jenking脫鈣液的脫鈣效果和染色結(jié)果。方法取小鼠膝關(guān)節(jié)骨組織分為6份，根據(jù)脫鈣條件和脫鈣液的不同，分為常溫脫鈣組合加溫脫鈣組兩組。常溫脫鈣組：三種脫鈣液常溫（25℃）脫鈣48h并石蠟切片HE染色；加溫脫鈣組：三種脫鈣液70℃溫箱脫鈣6h并石蠟切片HE染色，并分別觀察骨組織在不同脫鈣液及脫鈣條件下的脫鈣效果及染色結(jié)果。結(jié)果常溫（25℃）脫鈣組標(biāo)本中，經(jīng)甲酸混合液脫鈣的骨組織較難切片，染色較差；經(jīng)Alexander硝酸甲醛液脫鈣的骨組織較易切片，染色較差；經(jīng)Jenking脫鈣液脫鈣的骨組織較易切片，染色較好。加溫脫鈣組標(biāo)本中，經(jīng)甲酸混合液脫鈣的骨組織較易切片，染色較好；經(jīng)Alexander硝酸甲醛液脫鈣的骨組織較易切片，染色一般；經(jīng)Jenking脫鈣液脫鈣的骨組織較易切片，染色較好。結(jié)論不同的脫鈣液種類及脫鈣條件對(duì)脫鈣及染色結(jié)果有較大的影響，標(biāo)本經(jīng)三種脫鈣液加溫脫鈣后，使脫鈣時(shí)間大大縮短，減少了酸對(duì)組織的破壞，在脫鈣效果及染色結(jié)果方面，均要優(yōu)于常溫脫鈣，而Jenking脫鈣液無(wú)論在常溫和加溫條件下的脫鈣和染色效果均要優(yōu)于其它兩種脫鈣液，有一定的應(yīng)用價(jià)值。

脫鈣液；脫鈣方法；骨組織制片

在組織切片過(guò)程中，一些組織內(nèi)含有骨質(zhì)或鈣化時(shí)，較難切出完整的切片。對(duì)于這些組織必須進(jìn)行脫鈣處理后，才能進(jìn)行切片染色。一般脫鈣過(guò)程需要2天左右，如果骨及鈣化組織密度較高，則需要更長(zhǎng)的脫鈣時(shí)間，會(huì)降低工作效率。在脫鈣過(guò)程中往往需要用酸進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間處理，而酸在脫鈣的過(guò)程中必然會(huì)對(duì)組織造成一定程度的損傷，且脫鈣時(shí)間越長(zhǎng)，損傷程度就越大，必然會(huì)對(duì)后續(xù)的病理制片及病理診斷造成一定的影響。用于脫鈣的酸的種類繁多，脫鈣效果及脫鈣時(shí)間又不盡相同，如何選擇一種合適的脫鈣液，并盡量縮短脫鈣時(shí)間，顯得至關(guān)重要[1]。作者選擇幾種常用的脫鈣液，在不同的溫度條件下進(jìn)行脫鈣處理及切片染色，并觀察幾種脫鈣液在不同條件下的脫鈣效果及染色結(jié)果，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

材料和方法

1 主要儀器及試劑

Leica2245石蠟切片機(jī)（Lciea公司，德國(guó)），Leica PEORISII脫水機(jī)（Lciea公司，德國(guó)）；DHG-9023A電熱恒溫干燥箱（上海一恒科技公司）。甲酸混合液（甲酸20ml，10%甲醛5ml，蒸餾水75ml）；Alexander硝酸甲醛液（硝酸7ml，甲醛5ml，蒸餾水100ml）； Jenking脫鈣液（濃鹽酸4cm，冰醋酸3cm，氯仿10ml，無(wú)水乙醇73ml，蒸餾水10ml）[2]；Harris蘇木素（蘇木素2.5g，無(wú)水乙醇25ml，鉀明礬50g，蒸餾水500ml，黃色氧化汞1.25g，冰醋酸20ml）；1%水溶性伊紅乙醇液（伊紅1g，蒸餾水75ml，95%乙醇25ml，冰醋酸0.5ml）。

2 標(biāo)本來(lái)源

購(gòu)自作者單位實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)用健康小鼠，脊髓脫臼法處死，取膝關(guān)節(jié)骨組織，分為6份，根據(jù)脫鈣溫度和脫鈣液的不同，分為常溫脫鈣組和加溫脫鈣組。

3 標(biāo)本處理及染色方法

小鼠膝關(guān)節(jié)骨組織6份，分別入三種脫鈣液，常溫脫鈣組將標(biāo)本于常溫（25℃）下脫鈣48h，加溫脫鈣組將標(biāo)本于70℃恒溫箱內(nèi)脫鈣6h，兩組脫鈣標(biāo)本在脫鈣結(jié)束后取出，流水沖洗6h，脫水機(jī)常規(guī)脫水處理并石蠟包埋，石蠟切片厚4μm，70℃烤箱烤片20min，二甲苯I脫蠟5min，二甲苯Ⅱ脫蠟5min ，無(wú)水乙醇1min，95%乙醇1min，85%乙醇1min，75%乙醇1min，自來(lái)水洗2min，蒸餾水洗2min，Harris蘇木素5min，自來(lái)水洗1min，75%鹽酸乙醇液分化30s，自來(lái)水洗5min，1%伊紅液1min，95%乙醇I1min，95%乙醇Ⅱ1min，無(wú)水乙醇I1min，無(wú)水乙醇Ⅱ1min，二甲苯I1min，二甲苯Ⅱ1min，中性樹(shù)膠封片。

結(jié) 果

常溫脫鈣組中，骨組織經(jīng)甲酸混合液脫鈣后制片較難，染色較差；經(jīng)Alexander硝酸甲醛液脫鈣后制片較易，染色較差；經(jīng)Jenking脫鈣液脫鈣后制片較易，染色較好。加溫脫鈣組中，骨組織經(jīng)甲酸混合液脫鈣后制片較易，染色清晰；經(jīng)Alexander硝酸甲醛液脫鈣后制片較易，染色一般；經(jīng)Jenking脫鈣液脫鈣后制片較易，染色較好（圖1）。常溫脫鈣及加溫脫鈣制片及染色效果對(duì)比見(jiàn)表1和表2。

圖1 骨組織不同溫度下3種脫鈣液脫鈣HE染色效果比較。比例尺，50μmFig. 1 Comparison of three decalcification agents on decalcification and HE staining effects at different temperatures. Scale bar, 50μm

表1 常溫（25℃）條件下三種脫鈣液脫鈣效果及染色結(jié)果Tab. 1 Decalcification efficiency and staining results of three decalcification agents at normal temperature (25℃)

表2 加溫（70℃）條件下三種脫鈣液脫鈣效果及染色結(jié)果Tab. 2 Decalcification effect and staining results of three decalcification agents at increased temperature (70℃)

討 論

骨組織是一種堅(jiān)硬的結(jié)締組織，內(nèi)含有大量無(wú)機(jī)鹽，主要是羥磷灰石-磷酸鈣和碳酸鈣。病理組織中所見(jiàn)的鈣鹽類沉著，多為結(jié)核及其他各種壞死灶和某些腫瘤組織內(nèi)。骨及鈣化組織在病理診斷中具有重要意義：如骨發(fā)生的各種腫瘤、以及各種組織的鈣化（如結(jié)核病干酪性壞死灶的鈣化，脂肪組織壞死等產(chǎn)生的鈣化）、在病理性鈣化及骨化的病理診斷和研究（各種陳舊病灶的鈣化、骨折的修復(fù)、骨化性肌炎、陳舊性瘢痕組織骨化的觀察）、在某些骨性腫瘤及畸胎瘤的診斷和鑒別診斷（如鈣化上皮瘤、腦膜瘤、卵巢漿液性囊腺瘤、子宮平滑肌瘤、甲狀腺乳頭狀瘤及畸胎瘤）等[3]。

骨和鈣化組織一般不能直接切片，必須先脫去鈣質(zhì)，合理的脫鈣時(shí)間和脫鈣液，是完成骨組織切片的關(guān)鍵。脫鈣過(guò)程中往往需要酸的處理，用于脫鈣的酸的種類繁多，脫鈣效果及脫鈣時(shí)間也各不相同，酸在短時(shí)間內(nèi)可脫去大量的鈣，但酸對(duì)組織脫鈣的同時(shí)也會(huì)對(duì)組織產(chǎn)生酸化，骨組織在脫鈣液中時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響后續(xù)切片及染色的效果；如何選擇一種合適的脫鈣液，及盡量縮短脫鈣時(shí)間，顯得至關(guān)重要。

在我們所選擇的三種脫鈣液中，甲酸性質(zhì)溫和，對(duì)組織的破壞程度較輕，但甲酸的作用較弱，脫鈣速度較慢，在常溫脫鈣組實(shí)驗(yàn)中，相同脫鈣條件下脫鈣后，脫鈣效果不如其它兩種脫鈣液，制片不易，染色效果一般[4]。在加溫鈣組實(shí)驗(yàn)中，骨組織經(jīng)加溫脫鈣后，脫鈣效果明顯提升，制片容易，且組織結(jié)構(gòu)完整，染色也較滿意。

硝酸是一種廣泛使用的脫鈣液，其脫鈣能力強(qiáng)，脫鈣時(shí)間短，但對(duì)組織損傷大，脫鈣時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)引起組織的破壞，影響染色效果。經(jīng)硝酸脫鈣后組織腫脹明顯，細(xì)胞核的染色能力下降，組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)難以保持完整清晰，對(duì)比度差[5]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，常溫條件下硝酸脫鈣完全，組織制片容易，但因脫鈣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酸對(duì)組織損傷較大，染色效果不理想；加溫脫鈣條件下使脫鈣時(shí)間縮短，減少了酸對(duì)組織的損傷，不但骨組織能夠脫鈣完全使制片容易，而且染色效果相對(duì)常溫脫鈣也得到了提高。

Jenking液是一種混合脫鈣液，脫鈣液中的鹽酸作用溫和，對(duì)脫鈣組織造成的損害小，不會(huì)使組織膨脹，冰醋酸可使骨組織軟化，有利于切片；在脫鈣液內(nèi)加入氯仿可防止脫鈣組織因脫鈣后導(dǎo)致切片染色偏紅，甲醛不但在脫鈣的時(shí)候能同時(shí)固定組織，還可適度保護(hù)組織免受酸的侵蝕。這種脫鈣液對(duì)組織損傷小，脫鈣時(shí)間短，脫鈣后所制作的組織切片結(jié)構(gòu)顯示清晰，切片中的軟組織和骨組結(jié)構(gòu)均完整顯示，細(xì)胞核染色清晰，核質(zhì)對(duì)比鮮明[6]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在常溫脫鈣和加溫脫鈣兩組實(shí)驗(yàn)中，骨組織脫鈣效果都較好，組織制片容易，結(jié)構(gòu)完整，染色清晰，對(duì)比鮮明，無(wú)論脫鈣效果及染色方面，都取得了較為滿意的結(jié)果。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于脫鈣液的種類不一樣，脫鈣的效果及對(duì)組織的損害也不一樣。在同等條件下，酸的脫鈣性能越強(qiáng)，脫鈣所用時(shí)間越短，脫鈣也比較徹底，但對(duì)組織的損害也就越大，染色也會(huì)越差；酸的脫鈣能力弱，對(duì)組織的損害小，但脫鈣效果不太理想，會(huì)影響切片，如在實(shí)驗(yàn)中所選擇的三種脫鈣液中，硝酸和甲酸兩腫脫鈣液，硝酸脫鈣能力強(qiáng)，脫鈣徹底，切片容易，但染色較差；甲酸性質(zhì)溫和，對(duì)組織損傷小，但脫鈣效果不如硝酸，會(huì)影響切片；Jenking脫鈣液中的鹽酸和冰醋酸作用溫和，對(duì)組織損傷小，但綜合脫鈣能力強(qiáng)，且加入氯仿可保護(hù)組織并提高染色質(zhì)量，無(wú)論制片還是染色都能取得滿意結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加溫條件下的脫鈣時(shí)間明顯小于常溫條件下脫鈣，一般常溫脫鈣需要48h左右，而加溫脫鈣一般6h左右就能脫鈣完全，說(shuō)明溫度在脫鈣過(guò)程中起到了一定的作用[7]。加溫不但脫鈣效果較好，制片更容易，而且減少了酸對(duì)組織的損傷，染色結(jié)果也較好，而且加溫脫鈣能使脫鈣時(shí)間縮短，能大大提高工作效率。

需要注意的是，骨組織脫鈣應(yīng)先固定后脫鈣或固定脫鈣同時(shí)進(jìn)行，否則未經(jīng)固定的骨組織在酸性脫鈣液中會(huì)受到更大的損傷，鏡下觀察組織會(huì)模糊不清，甚至根本看不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)。脫鈣程度的控制應(yīng)在不影響組織切片的情況下盡量縮短脫鈣時(shí)間，以免造成因脫鈣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起組織損傷影響染色結(jié)果或脫鈣時(shí)間不足導(dǎo)致的切片困難。在組織脫鈣后，要立即將組織中的酸中和掉，采用堿性處理液中和或流水沖洗處理的方法均可，以免染色時(shí)組織紅染而影響切片染色質(zhì)量及病理診斷。

[1] 胥維勇，楊群. 脫鈣方法與脫鈣液的選擇及應(yīng)用. 中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2002，11（3）：263.

[2] 龔志錦，詹镕洲. 病理組織制片和染色技術(shù). 上海科學(xué)技術(shù)出版社，1994（1）：51-52.

[3] 羅燦嶠，莫木瓊，鐘覺(jué)民. 不同的脫鈣液在骨組織制片中的比較應(yīng)用. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2011，6（19）：27-28.

[4] 黃勛福，毛榮軍，房惠瓊，等. 骨組織甲酸脫鈣濃度探討. 實(shí)用醫(yī)技雜志，2009，16（3）：226.

[5] 王紅梅，趙春玉，牟陽(yáng)，等. 改良的硝酸脫鈣液HE制片方法探討. 實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2005，19（2）：151-151.

[6] 龔志錦，詹镕洲. 病理組織制片和染色技術(shù). 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994（1）：282-283.

[7] 張婉儀，阮君，丘展龍，等. 骨組織病理制片三種脫鈣液的比較. 吉林醫(yī)學(xué)，2014，35（10）：2083-2084.

Comparison for decalcifying effect of three decalcification reagents in the bone tissue

Chen Jingwen1*, Zhang Wei2, Wang Tianwa1, Cheng Jun1, Luo Jinfeng1(1Department of Pathology, Shenzhen People’s Hospital,Shenzhen 518020, China;2Department of Pathology Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China)

ObjectiveTo compare decalcification and subsequent staining effects of 20% formic acid, Alexander nitric acidformaldehyde solution and Jenking decalcification solution under normal and increased temperature.MethodMouse knee joint bone tissues were obtained and divided into 6 groups∶ 3 decalcification agents under either room temperature (25°C) or increased temperature(70°C). The decalcification lasted 48 and 6 hours for normal and increased temperature groups respectively, followed by paraffin section and HE staining. The decalcification efficiency and staining results were evaluated. ResultAmong those that were decalci fi ed under normal temperature, bone tissues were most difficult to slice in 20% formic acid treated group and HE staining worked best in Jenking decalcification solution treated group. With increased temperature, bone tissues were easier to slice in all groups than they were under normal temperature. Overall the HE staining was good except in Alexander nitric acid-formaldehyde solution group.ConclusionDifferent decalcification agents and conditions directly Influence decalcification efficiency and staining effects. Increasing temperature not only shortened decalcification time and reduced tissue damage by acids, but also showed better decalcification and staining results than normal temperature. Jenking decalcification solution, which was superior in all criteria, had potential application value.

decalcification agent; decalcification method; bone tissue section

R361.2

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 018

2017-03-21

2017-10-08

陳敬文，男（1978年），漢族，主管技師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：a780916@163.com