吳昊，袁靜萍，閻紅琳，周亨

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科，武漢 430060）

技術(shù)方法

改良高錳酸鉀-草酸脫黑色素法在黑色素瘤蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學(xué)檢測中的應(yīng)用

吳昊，袁靜萍*，閻紅琳，周亨

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科，武漢 430060）

目的通過比較不同條件下高錳酸鉀-草酸脫黑色素法在蘇木素-伊紅染色（hematoxylin-eosin，HE）和免疫組織化學(xué)檢測中的應(yīng)用，探討最佳脫色條件。方法取富含黑色素的黑色素瘤組織切片，分別在40℃、45℃、50℃、55℃的0.5%高錳酸鉀中脫色，每種溫度下分別孵育2min、4min、6min、8min，然后1%草酸溶液處理30s×3次，水洗1min，比較HE染色效果，選取效果最好的高錳酸鉀脫色條件（溫度、時間）?；贖E最佳染色條件，將高錳酸鉀處理時間減少2min，1%草酸溶液處理30s×3次，觀察免疫組化染色效果。結(jié)果標(biāo)本經(jīng)0.5%高錳酸鉀溶液，55℃水浴加熱4min，1%草酸溶液處理30s×3次，HE染色效果最好；在此基礎(chǔ)上，將處理時間減少到2min，免疫組織化學(xué)染色效果更好。結(jié)論改良后的高錳酸鉀-草酸脫黑色素法既能徹底脫去組織內(nèi)的色素顆粒，又能較完整的保留組織的抗原性，滿足了臨床病理對惡性黑色素瘤的診斷及鑒別診斷的需求。

高錳酸鉀-草酸脫黑色素法；黑色素瘤；改良

某些含有黑色素的腫瘤組織因黑色素沉積過多，可遮蓋細(xì)胞，干擾免疫組織化學(xué)抗原與抗體的結(jié)合，并且色素本身的顏色也影響免疫組織化學(xué)染色的判讀，嚴(yán)重影響最終的診斷。為了得到更好的HE及免疫組織化學(xué)染色效果，必須有效的加以祛除組織中的黑色素。通過廣泛查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)很多學(xué)者對這個問題進(jìn)行了有益的探索[1-4]，但在反復(fù)實踐中也發(fā)現(xiàn)了一些問題，因此我們在他人實驗的基礎(chǔ)上逐步改良、優(yōu)化，摸索出具有可操作性、重復(fù)性強(qiáng)的改良版高錳酸鉀-草酸加熱脫黑色素方法。

材料與方法

1 病例選擇與一般資料

選取本院2015年1月至2015年12月病理確診為黑色素瘤，且富含黑色素顆粒的存檔蠟塊27例，眼球9例、體表皮膚7例、直腸3例、鼻腔3例、舌根1例、胸椎管1例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤3例。另選取2例無色素性的惡性黑色素瘤病例作為對照。

2 主要試劑

0.5%高錳酸鉀溶液：0.5g高錳酸鉀+100ml蒸餾水；1%草酸溶液：1g草酸+100ml蒸餾水；免疫組織化學(xué)單抗（HMB45、S-100、Melan A均為即用型）及MA2000二抗試劑盒均購自中衫公司。

3 操作步驟

先針對HE染色結(jié)果摸索0.5%高錳酸鉀所對應(yīng)的處理溫度及時間，再確定免疫組織化學(xué)染色之前的脫黑色素的條件。①標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)切片，厚3μm，均用防脫玻片撈片。②常規(guī)烤片、脫蠟至水。③切片放置于盛放0.5%高錳酸鉀的耐高溫塑料盒中，水浴加熱，分別行40℃、45℃、50℃、55℃4種處理方法，每種溫度下分別孵育2min、4min、6min、8min，依次取出玻片，流水洗1min，1%草酸溶液處理30s×3次，水洗1min，同時設(shè)置空白對照將不做脫色處理的切片置于PBS中，然后行常規(guī)HE染色并鏡下比較染色效果。④根據(jù)步驟3中HE染色效果，選取脫色效果好的一組處理方法（溫度、時間）脫色、1%草酸溶液處理30s×3次作為第一組，再在第一組的高錳酸鉀處理溫度下將處理時間減少一個時間梯度（2min）進(jìn)行脫色、1%草酸溶液處理30s×3次作為第二組，不脫色的玻片放入PBS中作空白對照，然后將切片用pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液隔熱高壓修復(fù)噴氣1.5min，兩步法免疫組織化學(xué)操作按照說明書上進(jìn)行并鏡下比較染色效果。

結(jié) 果

圖1 改良高錳酸鉀-草酸脫黑色素法在黑色素瘤蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學(xué)檢測中的應(yīng)用。A，內(nèi)源性黑色素顆粒遮蓋了瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；B，脫色處理后，HE染色清晰，無黑色素顆粒殘留；C，無黑色素的足皮膚黑色素瘤病例未經(jīng)脫色處理的HE染色效果；D，無黑色素的足皮膚黑色素瘤病例經(jīng)脫色處理的HE染色效果；E，未經(jīng)脫色處理HMB45免疫組織化學(xué)染色效果；F，未經(jīng)脫色處理S-100免疫組織化學(xué)染色效果；G，經(jīng)脫色處理后HMB45免疫組織化學(xué)染色效果；H，經(jīng)脫色處理后S-100免疫組織化學(xué)染色效果；比例尺，50μmFig. 1 Applying modified potassium permanganate - oxalic acid method to bleach melanin in hematoxylin eosin staining and immunohistochemical of melanoma. A, in untreated melanoma tissue section, the morphological structure was obscued by endogenous melanin granules; B, after bleaching, the background in HE staining was reduced with few remaining melanin granules; C, the unbleached HE staining in non pigmented foot melanoma skin; D,the bleached HE staining in non pigmented foot melanoma skin. E, HMB45 immunohistochemical staining without bleaching; F, S100 immunohistochemical staining without bleaching. G, HMB45 immunohistochemical staining with bleaching. H, S100 immunohistochemical staining with bleaching;scale bar, 50μm

27例標(biāo)本在未脫黑色素之前，HE染色都可見濃密的黑色素顆粒沉積（圖1A）。標(biāo)本經(jīng)40℃、45℃、50℃、55℃的0.5%高錳酸鉀溶液處理不同的時間，結(jié)果顯示溫度越高、時間越長，脫色素越徹底，但組織結(jié)構(gòu)的破壞也越嚴(yán)重，與HE染料的親和力降低（表1）。綜合比較，標(biāo)本經(jīng)0.5%高錳酸鉀溶液，55℃水浴加熱4min，1%草酸溶液處理30s×3次，HE染色最清晰，背景干凈，無黑色素顆粒殘留（圖1B）。另選的無色素性的惡性黑色素瘤病例經(jīng)過同樣的脫色素處理前后HE染色效果相同，無組織損傷(圖1C，圖1D)。

未經(jīng)脫色素處理的切片行HMB45（圖1E）、S-100（圖1F）等免疫組織化學(xué)染色，內(nèi)源性濃密的黑色素顆粒干擾了DAB顯色的陽性著色，無法準(zhǔn)確判讀結(jié)果。根據(jù)HE染色結(jié)果，我們比較了0.5%高錳酸鉀溶液，55℃水浴加熱2min和4min，然后經(jīng)1%草酸溶液處理30s×3次后免疫組化的效果。結(jié)果顯示在同樣的處理溫度下，將處理時間減少到2min，HMB45（圖1G）、S-100（圖1H）等免疫組織化學(xué)染色顯色背景干凈，著色部位準(zhǔn)確，強(qiáng)度尚好，比用0.5%高錳酸鉀溶液55℃水浴加熱4min的第一組染色效果更好。此外，對無色素性的惡性黑色素瘤病例經(jīng)0.5%高錳酸鉀溶液，55℃水浴加熱2min，1%草酸溶液處理30s×3次處理前后對比免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)結(jié)果相同，進(jìn)一步驗證了此脫色素方法對組織抗原性無影響。

表1 高錳酸鉀處理溫度及時間對HE染色結(jié)果的影響Tab. 1 effect of temperature and time of potassium permanganate on HE stain

討 論

惡性黑色素瘤的組織中大多含有黑色素顆粒，這些黑色素顆粒沉積在組織和細(xì)胞中，影響細(xì)胞異型性、核分裂象的觀察，阻礙抗原抗體的結(jié)合，黑色素顆粒的顏色也干擾DAB的顯色系統(tǒng)，從而影響免疫組織化學(xué)染色的判讀結(jié)果。

黑色素由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生，影響黑色素生物合成的因素包括很多，如黑色素細(xì)胞周圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)改變、體內(nèi)的細(xì)胞因子、多種激素等等。酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，起著至關(guān)重要的重要，其催化酪氨酸相繼生成多巴、多巴醌、多巴色素、二羥基吲哚，最終轉(zhuǎn)化為黑色素顆粒。傳統(tǒng)的祛除黑色素方法有：氯化鉀乙醇鹽酸法、高錳酸鉀草酸法、溴水脫色法、鉻酸脫色法、過氧化氫脫色法、過氧乙酸脫色法[5]。但是這些傳統(tǒng)方法大多都需要處理切片2h以上，為了保護(hù)組織抗原性必須加以改良。郭以河等[1]采用0.5%高錳酸鉀處理組織8min的快速祛除黑色素的方法，筆者在相同條件下處理50min時效果仍不理想。范慧等[2]采用電爐隔水加熱0.5%的高錳酸鉀溶液，待水將沸未沸，去火，進(jìn)行脫黑色素，我們在多次實驗過程中，并不能每次都取得良好的脫色效果，此方法可重復(fù)性比較欠缺。因此尋找一種脫色率高，保證組織結(jié)構(gòu)完整，不破壞抗原，重復(fù)性好的簡單快捷的黑色素祛除方法必須明確處理的具體溫度及時間。高錳酸鉀脫色素是一種較強(qiáng)的氧化劑，處理溫度越高、時間越長，對色素的漂白作用越明顯，脫色素越徹底，但這種強(qiáng)氧化性對組織結(jié)構(gòu)的破壞也更明顯，抗原性的丟失現(xiàn)象也越嚴(yán)重。因此，關(guān)鍵在于處理脫色溫度、時間、組織結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性四者矛盾。

經(jīng)過反復(fù)實踐，筆者發(fā)現(xiàn)用0.5%高錳酸鉀溶液水浴加熱50℃、8min時，黑色素已經(jīng)有部分褪去，但組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所破壞。當(dāng)水浴溫度提高到55℃、加熱4min時，HE染色清晰，背景干凈，無黑色素顆粒殘留；加熱到6min、8min時，HE染色較灰暗，核質(zhì)染色對比不清晰。故推薦標(biāo)本經(jīng)0.5%高錳酸鉀溶液，55℃水浴加熱4min，1%草酸溶液處理30s×3次，HE染色清晰，背景干凈，組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞形態(tài)完整，祛除黑色素顆粒效果最好。另外，用1%草酸溶液漂白時，分多次處理達(dá)到漂白效果即可，有利的避免了因草酸處理時間過長影響HE及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。在探索免疫組織化學(xué)染色前脫色素的條件時，考慮到后期抗原修復(fù)會不會對色素有進(jìn)一步的祛除作用，為了有效的保持組織的抗原性，應(yīng)盡可能的減少高錳酸鉀溶液的處理時間，因此，做了加熱2min、4min的對比實驗，結(jié)果證實了0.5%高錳酸鉀溶液55℃水浴加熱2min，1%草酸溶液處理30s×3次，行免疫組織化學(xué)染色，顯色背景干凈，著色部位準(zhǔn)確，強(qiáng)度尚好。同時，我們在對無色素性的惡性黑色素瘤病例用同樣的脫色素方法處理前后對比，HE及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果無明顯不同。

我們經(jīng)過反復(fù)實驗，探索出了分別適用于HE及免疫組織化學(xué)染色之前的脫色素實驗條件，既能徹底脫去組織內(nèi)的色素顆粒，又能較完整的保留組織的抗原性，滿足了臨床病理對惡性黑色素瘤的診斷及鑒別診斷。

[1] 郭以河，張閩峰，孟家榕，等. 快速祛除組織中黑色素的改良方法. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2011，27（2）：214.

[2] 范慧，李白彥，鄒燁，等. 兩種快速脫黑色素的方法. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2007，23（6）：723.

[3] 劉瑩，蘇貞輝. 免疫組化標(biāo)記前脫黑色素的方法和體會.診斷病理學(xué)雜志，2012，19（1）：79.

[4] 于曉東，湯英姿，唐應(yīng)成，等. 一種簡單快速祛黑色素的改良方法. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2013，29（7）：808.

[5] 龔志錦，詹镕洲. 病理組織制片和染色技術(shù). 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1993：185.

Application of modified potassium permanganate-oxalic acid melanin-bleaching method in hematoxylin eosin staining and immunohistochemisty of melanoma

Wu Hao, Yuan Jingping*, Yan Honglin, Zhou Heng
(Department of Pathology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)

ObjectiveTo identify the optimal potassium permanganate - oxalic acid bleaching method in removal of melanin in hematoxylin-eosin (HE) staining and immunohistochemistry of melanoma.MethodsMelanoma tissue sections riched in melanin were emersed in 0.5% potassium permanganate solution at 40℃, 45℃, 50℃and 55℃ for 2, 4, 6 and 8 minutes, respectively. The sections were then treated with 1% oxalic acid solution for 3 cycles of 30 seconds followed by one minute water rinse. Based on the conditions which gave the best HE staining depigmentation effect, the same method was further optimized in immunohistochemistry.ResultsSpecimens treated with 0.5% potassium permanganate solution at 55℃ for 4 minutes followed by 3 cycles of 1% oxalic acid incubation for 30 seconds showed a better depigmentation effect in HE staining. On the same base, immunohistochemical staining worked best when the potassium permanganate incubation time was reduced to 2 minutes.ConclusionThe modified potassium permanganateoxalic acid method not only completely removed melanin pigment granules within tissue sections, but also preserved tissue antigenicity which met the requirements of clinical pathology in the diagnosis and differential diagnosis of malignant melanoma.

Potassium Permanganate - Oxalic acid method; melanoma; modify

R446.8

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 015

2017-05-02

2017-09-18

國家自然科學(xué)基金（31600866）；武漢大學(xué)自主科研項目（2042016kf0116）

吳昊，男（1990年），漢族，技師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：yuanjingping2003@aliyun.com