曹婷婷　劉久石　高石曼　孫恬　覃婕媛　景浩　齊耀東　張本剛　劉海濤　肖培根

[摘要]采用HPLCELSD建立了黨參藥材中具有“甜味”的3種游離態(tài)糖類成分的含量測定方法，為補充和完善黨參藥材的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。方法學考察結(jié)果顯示蔗糖、葡萄糖、果糖分別在2312 5～18500 0，1500 0～12000 0， 2000 0～16000 0 μg呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為9631%，1004%，1018%。該方法操作簡便，穩(wěn)定可靠，結(jié)果準確，適合黨參藥材中蔗糖、葡萄糖、果糖3種游離態(tài)糖類成分的同時檢測。應(yīng)用建立的分析方法對甘肅省岷縣黨參藥材規(guī)范化種植基地不同栽培措施種植的黨參藥材樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)不同栽培措施對黨參藥材中3種游離態(tài)糖類成分具有一定的影響，其中，按照蔗糖含量的高低順序為：施用壯根靈>不施用壯根靈，不打尖、搭架>不打尖、不搭架>打尖、不搭架>打尖、搭架；按照葡萄糖、果糖含量的高低順序為：不施用壯根靈>施用壯根靈，打尖、搭架>不打尖、不搭架>不打尖、搭架>打尖、不搭架。因不同游離態(tài)糖類成分甜度和含量均具有差異性，因此可考慮將游離態(tài)糖類成分的含量作為黨參藥材的評價指標。

[關(guān)鍵詞]黨參； 栽培措施； 游離態(tài)糖； 含量測定

[Abstract]To provide a scientific evidence for the quality control of Codonopsis Radix， a method was established for determining the content of three free carbohydrates of Codonopsis Radix The developed method showed good linearity The calibration curves were linear within the range of 2312 518500 0 μg for sucrose， 1500 012000 0 μg for glucose， and 2000 016000 0 μg for fructose， resgectwely The recoveries varied between 9631%1018% The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for determining the content of sucrose， glucose and fructose of Codonopsis Radix The results showed that different cultivation measures had an effect on the content of three free carbohydrates of Codonopsis Radix According to the content of sucrose， using Zhuanggenling>not using Zhuanggenling While， not pinching， shelving>not pinching， not shelving>pinching， not shelving>pinching， shelving According to the content of glucose and fructose， not using Zhuanggenling>using Zhuanggenling While， pinching， shelving>not pinching， not shelving>not pinching， shelving>pinching， not shelving In consideration of the differences of sweetness and content of the three free carbohydrates in Codonopsis Radix， we recommend that the content of free carbohydrates could be considered as the marker to evaluate the quality of Codonopsis Radix.

[Key words]Codonopsis Radix； cultivation measures； free carbohydrates； quantitative analysis

黨參為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula （Franch） Nannf、素花黨參C pilosula Nannf var modesta （Nannf） L T Shen或川黨參C tangshen Oliv的干燥根，具有健脾益肺，養(yǎng)血生津等功效，主要用于治療脾肺氣虛，食少倦怠，咳嗽虛喘，氣血不足等癥[1]，其化學成分主要有三萜、糖類、甾類、木脂素、倍半萜、黃酮等[23]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參可以顯著提高機體免疫力，具有促進造血機能、清除自由基、增強機體免疫力、延緩衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)胃收縮及抗?jié)兊榷喾N作用[45]。

自古以來，“味甜者佳”就是鑒別黨參藥材品質(zhì)的一項重要感官指標，老藥工或老中醫(yī)常使用這一感官指標對黨參藥材的品質(zhì)進行判斷，至今仍在使用，但卻缺乏相應(yīng)的科學闡述?！吨袊幍洹罚?015年版）中尚未規(guī)定黨參藥材的指標成分，因此，急需找到科學、合理的指標用于評價黨參藥材的品質(zhì)。多糖是黨參藥材發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、增強造血功能的主要活性成分，同時影響著黨參藥材的口感。目前的研究多采用紫外分光光度法測定總多糖含量作為黨參藥材品質(zhì)評價的指標，然而總多糖缺乏專屬性特征，限制了這一指標在實際過程中的應(yīng)用[6]。關(guān)于多糖的組成及化學結(jié)構(gòu)等方面的研究相對較少，在多糖的研究中，游離態(tài)糖類成分的分析是研究其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系的重要內(nèi)容[713]。因此，以游離態(tài)糖類成分為突破口，科學闡述黨參藥材的“甜味”品質(zhì)，對于提升黨參藥材的質(zhì)量評價具有重要的意義。endprint

目前，游離態(tài)糖類成分的檢測多采用比色法或HPLCRID法，前者只能測定游離態(tài)糖類成分總量，后者采用的RID法靈敏度低，受溫度影響大，系統(tǒng)平衡時間長。本研究以Agilent HiPlex Ca為色譜柱，采用HPLCELSD法測定黨參藥材中蔗糖、葡萄糖、果糖3種游離態(tài)糖類成分，基線穩(wěn)定、分離效果好，重復(fù)性好，且以純水作為流動相，減少了有機溶劑對環(huán)境的危害，體現(xiàn)了強大的環(huán)保和安全優(yōu)勢，是一種值得推廣應(yīng)用的糖類檢測方法。前期在對黨參藥材主產(chǎn)區(qū)的資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，施用壯根靈、打尖、搭架等栽培措施會對黨參藥材的產(chǎn)量及質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響。因此通過測定不同栽培措施的黨參藥材中3種游離態(tài)糖類成分的含量，研究不同栽培措施對黨參藥材中游離態(tài)糖類成分的影響。

1材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國），Agilent Technologies 380ELSD蒸發(fā)光散射檢測器，ChemStation工作站，AL204電子分析天平（METTLER TOLEDO）；水浴鍋HH8（常州國華電器有限公司）；MilliporQ超純水機（美國Millipore公司）。

蔗糖（中國食品藥品檢定研究院，純度>99%，批號111507201303）、D無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，純度>99%，批號110833201506）、果糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度>99%，批號100231201305），水為超純水（Millipore，Billerica，MA，USA）。

在甘肅省定西市岷縣十里鎮(zhèn)十里村黨參藥材規(guī)范化種植基地（34°29′ N，103°57′ E，2340 m），設(shè)計施用壯根靈、打尖、搭架等不同栽培措施實驗區(qū)6個，每個小區(qū)設(shè)3個重復(fù)，每個小區(qū)面積66 m2，并設(shè)置中間保護行1 m。樣品采集于2015年10月，共計18份，樣品采集信息見表1，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為桔?？浦参稂h參C pilosula，憑證標本保存于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所藥用植物資源研究中心。

2方法與結(jié)果

21色譜條件Agilent HiPlex Ca（77 mm×300 mm）色譜柱，流動相為超純水，流速05 mL·min-1，柱溫80 ℃。ELSD條件：漂移管溫度30 ℃，蒸發(fā)管溫度60 ℃，載氣流速14 L·min-1，增益1。

22對照品溶液精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過的蔗糖、葡萄糖、果糖對照品適量，精密稱定，加水分別制得每1 mL含37，24，32 mg的對照品混合溶液，并將對照品混合溶液稀釋2，4，6，8倍保存在4 ℃冰箱中，備用。

23提取工藝優(yōu)選在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，選擇提取溶劑、料液比、回流時間為考察因素，以游離態(tài)糖類成分總提取量為指標，按L9（33）正交表安排試驗，確定供試品溶液制備條件。因素水平見表2，試驗安排及結(jié)果見表3。

以所測得3種游離態(tài)糖類成分的含量總和為考察指標，結(jié)果顯示，對于黨參游離態(tài)糖類成分總量的提取各因素作用主次為提取溶劑>料液比>回流時間。最終確定黨參藥材中3種游離態(tài)糖類成分最佳提取工藝方案為A2B2C1，即使用純水作為提取溶劑，料液比為1∶50，加熱回流提取1 h。

24供試品溶液制備取黨參藥材樣品粉末（過4號篩）約1 g，精密稱定，置于100 mL具塞三角瓶中，精密加入水50 mL，稱重，加熱回流提取1 h，放冷，再稱重，用水補足失重，放冷，搖勻后，經(jīng)022 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

25線性范圍考察及定量限和檢測限測定分別精密吸取5種不同濃度的蔗糖、葡萄糖、果糖混合對照品溶液5 μL，按21項色譜條件測定含量，記錄色譜峰面積，以峰面積的自然對數(shù)值（Y）為縱坐標，以進樣量的自然對數(shù)值（X）為橫坐標，制作線性回歸方程，結(jié)果見表4，標準游離態(tài)糖類成分HPLC圖見圖1A。用混合對照品溶液逐級稀釋，按上述色譜條件進樣測定，定量限（S/N=10）和檢測限（S/N=3）測定結(jié)果見表4。

26精密度試驗精密吸取同一份黨參藥材供試品溶液5 μL，連續(xù)進樣6次，測得蔗糖、葡萄糖、果糖含量的RSD分別為14%，092%，049%，表明儀器的精密度良好。

27重復(fù)性試驗取同一份黨參藥材樣品，共取6份，精密稱定，分別按照24項方法制備供試品溶液，分別進樣5 μL，測得蔗糖、葡萄糖、果糖含量的RSD分別為28%，059%，099%，表明該方法重復(fù)性良好。

28穩(wěn)定性試驗取黨參藥材供試品溶液5 μL，分別在0，4，8，12，24 h各進樣1次，進樣量為5 μL，測得蔗糖、葡萄糖、果糖含量的RSD分別為29%，18%，15%，結(jié)果表明黨參藥材供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

29加樣回收率試驗稱取已知含量的黨參藥材樣品粉末1 g，精密稱定，共取9份，分別加入高、中、低3種不同質(zhì)量的蔗糖，葡萄糖，果糖對照品，按照24項方法制備加樣回收率供試液，分別進樣5 μL，記錄峰面積，計算回收率。得蔗糖、葡萄糖、果糖的平均回收率分別為9631%，1004%，1018%。（RSD 012%～050%，RSD 12%～22%，RSD 12%～19%），見表5。

210樣品測定取不同產(chǎn)地的黨參藥材樣品1 g，按上述色譜條件24項制備黨參藥材樣品供試品溶液，分別吸取5 μL進樣，根據(jù)線性回歸方程計算黨參藥材樣品中蔗糖、葡萄糖、果糖含量。黨參藥材樣品信息見表1，3種游離態(tài)糖類成分含量測定結(jié)果見表6，黨參藥材樣品中3種游離態(tài)糖類成分HPLC圖見圖1B。

211數(shù)據(jù)分析將18份黨參藥材樣品中蔗糖，葡萄糖，果糖的含量數(shù)據(jù)導入SPSS 21軟件進行分析，得到不同栽培措施的黨參藥材樣品中蔗糖，葡萄糖，果糖的含量的均值及變異程度，見圖2。方差分析結(jié)果表明，不同栽培措施的黨參藥材樣品中蔗糖，葡萄糖，果糖的含量有顯著性差異（P<005）。按照endprint

蔗糖含量的高低順序為：施用壯根靈>不施用壯根靈，不打尖、搭架>不打尖、不搭架>打尖、不搭架>打尖、搭架；按照葡萄糖含量的高低順序為：不施用壯根靈>施用壯根靈，打尖、搭架>不打尖、不搭架>不打尖、搭架>打尖、不搭架。按照果糖含量的高低順序為：不施用壯根靈>施用壯根靈，打尖、搭架>不打尖、不搭架>不打尖、搭架>打尖、不搭架。

3討論

糖類成分作為黨參藥材的主要活性成分，具有

1不施壯根靈；2施壯根靈；3不打尖、不搭架；4不打尖、搭架； 5 打尖、不搭架；6 打尖、搭架； 不同小寫字母表示在α=005水平上具有顯著差異。

圖2不同栽培措施黨參藥材樣品中3種游離態(tài)糖類成分的含量（±s，n=3）

Fig2Content of three free carbohydrates of Codonopsis Radix samples cultivated by different cultivation measures （±s，n=3）

抗衰老，抗腫瘤，促進胃腸消化功能等生理活性，在藥品、食品和保健食品開發(fā)等方面具有廣闊的市場空間。本研究首次采用HPLCELSD法測定了黨參藥材中3種游離態(tài)糖類成分的含量，相比目前測定游離態(tài)糖類成分常采用的比色法和HPLCRID法，該方法具有受溫度的影響較小，基線不易發(fā)生漂移，重復(fù)性與可靠性好等優(yōu)勢。

實驗比較了Agilent HiPlex Ca，Agilent ZORBAX Carbohydrate和Agilent Zorbax NH23種色譜柱，結(jié)果表明Agilent Zorbax NH2和Agilent ZORBAX Carbohydrate穩(wěn)定性差，固定相易流失，導致蒸發(fā)光檢測器所檢測得到的基線不穩(wěn)，而Agilent HiPlex Ca色譜柱對黨參藥材中3種游離態(tài)糖類成分的分析效果較好，且基線平穩(wěn)，滿足定量檢測的要求。同時Agilent HiPlex Ca（77 mm×300 mm）色譜柱的流動相為純水，沒有有機溶劑的使用，減少了有機試劑對環(huán)境的危害，且主要通過調(diào)節(jié)色譜柱的溫度和流速進行游離態(tài)糖類成分的分離，操作簡便，分離效果良好，準確度較高，適用于黨參藥材中游離態(tài)糖類成分的含量測定。同時，考察了漂移管溫度（30，35，40 ℃），霧化器溫度（50，60，70 ℃），霧化氣體流量（12，14，16 L·min -1）對分離效果的影響，結(jié)果表明漂移管溫度30 ℃，蒸發(fā)管溫度60 ℃，載氣流速14 L·min -1對黨參藥材中游離態(tài)糖類成分的分離效果較好。

另外，通過正交試驗優(yōu)化了黨參藥材中游離態(tài)糖類成分的提取條件，以3種游離態(tài)糖類成分的含量總和為考察指標進行分析，結(jié)果表明，各因素的影響排序為提取溶劑>料液比>回流時間。確定最佳提取工藝為純水作為提取溶劑，料液比為1∶50，加熱回流提取1 h。

綜上，建立了黨參藥材中蔗糖、葡萄糖、果糖3種游離態(tài)糖類成分的HPLCELSD檢測方法，該方法操作簡便，穩(wěn)定可靠，結(jié)果準確，為科學、合理地開展黨參藥材品質(zhì)評價提供了參考。

應(yīng)用建立的方法對不同栽培措施黨參藥材樣品中3種游離態(tài)糖類成分的含量進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同栽培措施的黨參藥材樣品中蔗糖、葡萄糖、果糖3種游離態(tài)糖類成分的含量差異具有顯著性，按照蔗糖含量的高低順序為：施用壯根靈>不施用壯根靈，不打尖、搭架>不打尖、不搭架>打尖、不搭架>打尖、搭架；按照葡萄糖含量的高低順序為：不施用壯根靈>施用壯根靈，打尖、搭架>不打尖、不搭架>不打尖、搭架>打尖、不搭架。按照果糖含量的高低順序為：不施用壯根靈>施用壯根靈，打尖、搭架>不打尖、不搭架>不打尖、搭架>打尖、不搭架。由此可見，不同栽培措施對黨參藥材中葡萄糖和果糖含量的影響具有一致性，對蔗糖含量的影響與前兩者不同，有研究表明，在植物發(fā)育早期，植物中主要糖類成分是果糖和葡萄糖，在發(fā)育后期，主要糖類成分是蔗糖，如在桃果實發(fā)育早期，果糖和葡萄糖含量較高，蔗糖含量較低，而在發(fā)育后期果糖和葡萄糖含量下降，蔗糖迅速積累[1416]，因此，造成不同栽培措施對黨參藥材中3種游離態(tài)糖類成分影響不一致的原因可能是不同栽培措施對黨參藥材不同發(fā)育時期的影響不同，其具體影響機制有待于進一步研究。

另外，由于不同的游離態(tài)糖類成分在甜度上存在差異，如果以蔗糖的甜度作為 1，果糖和葡萄糖的甜度則分別為 175 和 075[1718]，因此，黨參藥材在以“甜味”作為衡量其內(nèi)在品質(zhì)的標準時，不僅要取決于各離態(tài)糖類成分的含量，還取決于各游離態(tài)糖類成分的甜度差異，因此可考慮將游離態(tài)糖類成分的含量作為黨參藥材的評價指標。

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[責任編輯丁廣治]endprint