韓晟 陳衍

TRPM7離子通道在口腔鱗癌細胞增殖和遷移中的作用

韓晟 陳衍

目的探討TRPM7離子通道在口腔鱗癌細胞增殖和遷移中的作用。方法Western blotting，RT-PCR和間接免疫熒光法檢測口腔鱗癌細胞OC2中TRPM7的表達和細胞內(nèi)定位。MTT法和Transwell試驗分別檢測抑制TRPM7通道(2-APB、siRNA TRPM7)對OC2細胞增殖和遷移的影響。Western blotting檢測2-APB或siRNA TRPM7阻斷PI3K/AKT通路對OC2細胞中TRPM7的表達影響。采用膜片鉗技術初步探索干預TRPM7通道對OC2細胞陽離子通透的影響。結(jié)果OC2細胞中TRPM7過表達，主要表達在細胞質(zhì)中。阻斷TRPM7通道后，OC2細胞增殖和遷移能力受抑制，且呈濃度依賴性和時間依賴性。阻斷TRPM7通道后，抑制OC2細胞TRPM7可下調(diào)磷酸化AKT以及磷酸化ERK的表達，而對組成性AKT以及ERK的表達無明顯影響。膜片鉗技術顯示在TRPM7過表達的OC2細胞中TRPM7樣電流激活，2-APB 阻斷TRPM7通道后電流明顯減弱，而采用TRPM7通道活化劑Bradykinin后，電流明顯增強。結(jié)論TRPM7在口腔鱗癌細胞OC2中過表達，可能通過影響PI3K/AKT和MAPK-ERK信號轉(zhuǎn)導途徑以及陽離子內(nèi)流發(fā)揮對細胞增殖、遷移的調(diào)節(jié)作用。

口腔鱗癌； 瞬時受體電位家族成員7； 細胞增殖； 遷移

口腔鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤，晚期口腔鱗癌患者預后差，傳統(tǒng)治療方法有效率低，因此需要尋找新的治療靶點。近年來研究發(fā)現(xiàn)某些離子通道與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。很多離子通道在非興奮性組織起源的腫瘤中高表達，而在相同起源的正常組織中低表達或不表達。因此離子通道成為腫瘤研究領域新的熱點。瞬時受體電位家族成員TRPM7(transient receptor potential melastatin 7)組成性表達于興奮性和非興奮性細胞的質(zhì)膜上，參與細胞內(nèi)離子平衡的調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、細胞的黏附和遷移等重要生理過程[1]。TRPM7在多種腫瘤中過表達，與腫瘤細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移密切相關[2-5]。目前有關口腔癌相關離子通道的研究還很缺乏，本研究初步探討TRPM7離子通道在口腔鱗癌細胞增殖和遷移中的作用，不僅有助于進一步闡明口腔癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機制，并為基于該離子通道的口腔鱗癌靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人類口腔鱗癌細胞株OC2由第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院實驗中心保留。培養(yǎng)基采用以1∶1混合的Dulbecco培養(yǎng)基和Ham F12培養(yǎng)基，輔以10 胎牛血清和抗生素(50 U/L青霉素和50 U/L鏈霉素)溶液，以及2.5 mmol/L谷氨酰胺和400 g/L氫化可的松溶液。37 ℃含5% CO2的孵箱培養(yǎng)。免疫組化實驗時，將細胞接種于預先用多聚左旋鳥氨酸包被的蓋玻片上，生長3 d后用于實驗。

1.2 間接免疫熒光法觀察口腔鱗癌細胞OC2中TRPM7的表達和細胞內(nèi)定位

將OC2細胞按2×105/孔的密度分別接種于預先放置蓋玻片的6 孔板中，次日PBS洗滌后用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗后將細胞置于乙醇和乙酸(2∶1)混合液中快速冷卻5 min(-20 ℃)，室溫下加入預先用PBS稀釋的3 TritonX-100，作用20 min后加入由2%正常山羊血清和1%牛血清白蛋白組成的封閉緩沖液，孵育30 min后直接加入1∶100稀釋比例的TRPM7一抗(Abgent)， 4 ℃孵育過夜。 二抗選用稀釋比例1∶750的Cy3偶聯(lián)的羊抗兔抗體(Jackson Immunoresearch,Inc,USA)，室溫下孵育2 h， 避光。 DAPI封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 Western blotting法

提取細胞的總蛋白，配置電泳樣品。配置分離膠(TRPM7 75 g/L，其余120 g/L)和50 g/L的濃縮膠。等量樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，穩(wěn)流將蛋白電轉(zhuǎn)至甲醇預處理的PVDF膜上(TRPM7電轉(zhuǎn)5 h，其余電轉(zhuǎn)2 h)。轉(zhuǎn)膜、封閉后按流程分別加入一抗和二抗。暗室中發(fā)光、顯影和定影?？笰KT抗體、抗phospho-AKT(Ser473)、抗ERK 抗體、抗phospho-ERK(1/2)(Thr202/Tyr204)抗體購自Cell Signaling Technology,Inc,USA。

1.4 RT-PCR法檢測OC2中TRPM7的表達

Trizol法提取OC2細胞的RNA，RT-PCR擴增TRPM7 mRMA，引物設計：正義5'-AAACATGTTGGTGATGCCCTC-3'。 反義5'-CACACACAACAACTGGAA CGG-3'(NCBI accession no. NC_005102)。 RT-PCR擴增條件： 94 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共30 個循環(huán)(Clontech, CA)。

1.5 TRPM7-siRNA轉(zhuǎn)染

特異性TRPM7-siRNA合成序列設計為：5'-AAGCAGAGTGACCTGGTAGA T-3'。將細胞數(shù)預先稀釋至10 個細胞/ml；轉(zhuǎn)染試劑si PORTNeoFX(Ambion)和TRPM7 siRNA分別用Opti-MEMI低血清培養(yǎng)基(Invitrogen)按照1∶20進行稀釋，再將稀釋后的NeoFX和TRPM7-siRNA混合，形成轉(zhuǎn)染復合物；將含有轉(zhuǎn)染復合物的培養(yǎng)基先等分至24 孔板內(nèi)，再將稀釋后的細胞加入24 孔板，使每孔分別含有30 nmol/L終濃度的TRPM7-siRNA和10 個細胞。經(jīng)過TRPM7-siRNA轉(zhuǎn)染的細胞72 h后用于細胞毒評估。

1.6 MTT細胞增殖試驗

將細胞按3×103/孔的密度分別接種于96 孔板，給予上述細胞TRPM7通道抑制劑2-APB(0、10、100 mol/L)作用48 h后終止反應，MTT法測定細胞存活率和增殖曲線。均設復孔和對照孔。

1.7 Transwell 細胞遷移實驗

將Transwell小室(Corning)放入24 孔細胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)腫瘤細胞，胰酶消化后接種小室， 24 h后冰甲醛固定濾膜后進行HE染色。用棉簽輕輕拭去濾膜上表面未穿透的細胞，各選擇5個高倍鏡(×200)視野，分別計數(shù)濾膜下面和24孔板中的細胞數(shù)(穿膜細胞數(shù))，以穿膜細胞數(shù)表示其運動能力。

1.8 膜片鉗技術記錄細胞TRPM7通道全細胞電流

采用膜片鉗技術記錄細胞TRPM7通道全細胞電流，分析濃度梯度與電流關系。在無鈣離子的細胞外液(添加細胞外鈣離子螯合劑)中，膜片鉗技術記錄細胞TRPM7通道電流在TRPM7通道抑制劑(2-APB 100 mol/L)和激活劑(Bradykinin 10 μmol/L)作用下的電流變化情況。配置細胞外溶液：K-gluconate 5 mmol/L，Na-gluconate 140 mmol/L，CaCl21 mmol/L， MgCl21 mmol/L， glucose 5 mmol/L及HEPES 10 mmol/L， pH 7.4。細胞內(nèi)溶液：Na-gluconate 140 mmol/L，NaCl 4 mmol/L，EGTA 1 mmol/L，EDTA 1 mmol/L及HEPES 10 mmol/L，pH 7.2。葡萄糖酸鹽適量減少以維持合適的滲透壓。室溫下膜片鉗記錄全細胞離子，采用Axopatch 200B放大器(Axon Instruments, Foster City)及pClamp 9.2軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 口腔鱗癌細胞OC2中TRPM7的表達

采用間接免疫熒光法檢測OC2細胞中TRPM7的細胞內(nèi)定位，結(jié)果示TRPM7主要定位于胞質(zhì)中(圖 1)。采用Western blotting 和RT-PCR法檢測OC2中TRPM7的表達情況，結(jié)果顯示在OC2細胞中TRPM7過表達，siRNA TRPM7后TRPM7 的蛋白(圖 2A)和mRNA(圖 2B)表達水平均下調(diào)。

A: 熒光染色; B: DAPI染色

圖 1 OC2細胞中TRPM7蛋白的表達

(× 40)

A： Indirect immunofluorescence assay； B： DAPI staining

Fig 1 TRPM expression in OC2 cells

(× 40)

A: TRPM7蛋白表達； B： TRPM7 mRNA表達

2.2 抑制TRPM7對口腔鱗癌細胞系OC2生物學性狀的影響

為探討阻斷TRPM7通道對OC2細胞增殖的影響，給予TRPM7抑制劑2-APB(0、 10、 100 μmol/L)、siRNA TRPM7后，觀察對細胞生物學性狀的影響。MTT結(jié)果顯示，2-APB 阻斷TRPM7通道后OC2細胞生長和增殖受抑，且呈濃度依賴性和時間依賴性(圖 3)，100 μmol/L作用48 h時其抑制能力達到78.56%。同樣，給予siRNA TRPM7后，OC2細胞生長和增殖受抑，且呈時間依賴性，在作用48 h后，其細胞增殖能力下降約84.27%(圖 4)。此外，siRNA TRPM7后， OC2細胞的遷移能力受到明顯抑制，與對照組相比作用24 h其遷移能力下降71.09%(圖 5)。

圖 3 2-APB對OC2細胞增殖的影響

圖 4 siRNA TRPM7對OC2細胞增殖的影響

Fig 4 The effects of siRNA TRPM7 on the proliferation of OC2 cells

2.3 TRPM7通道可通過PI3K/AKT途徑對口腔鱗癌細胞系OC2的生長進行調(diào)控

為探討TRPM7通道對OC2細胞系PI3K/AKT和MAPK-ERK信號轉(zhuǎn)導通路的影響，對OC2細胞siRNA TRPM7后，采用Western blotting檢測AKT、磷酸化AKT、ERK以及磷酸化ERK的表達情況。結(jié)果顯示，抑制OC2細胞TRPM7可下調(diào)磷酸化AKT以及磷酸化ERK的表達，而對組成性AKT以及ERK的表達無明顯影響(圖 6)。

2.4 TRPM7通道對口腔鱗癌細胞系OC2陽離子通透的影響

采用膜片鉗技術探索TRPM7通道對OC2陽離子通透的影響。給予OC2細胞TRPM7通道抑制劑2-APB(100 μmol/L)或活化劑Bradykinin(10 μmol/L)，膜片鉗實驗檢測了OC2全細胞電流，結(jié)果顯示，在TRPM7過表達的OC2細胞中TRPM7樣電流激活，采用TRPM7通道抑制劑2-APB 阻斷TRPM7通道后電流明顯減弱，而采用TRPM7通道活化劑Bradykinin后，電流明顯增強(圖 7)。

圖 5 siRNA TRPM7對OC2細胞遷移能力的影響

圖 6 TRPM7對OC2細胞磷酸化AKT以及磷酸化ERK表達的影響

Fig 6 The effects of TRPM7 on the expression of phosphorylated AKT and phosphorylated ERK

圖 7 TRPM7對OC2細胞陽離子通透的影響

Fig 7 The effects of TRPM7 on the positive ion permeability of OC2 cells

3 討 論

TRPM7為TRPM亞家族成員，是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有離子通道和蛋白激酶雙重結(jié)構的“雙功能蛋白”，其對陽離子具有通透性，調(diào)控細胞內(nèi)Mg2+和Ca2+內(nèi)穩(wěn)定[1,6]。此外，TRPM7還作為一種絲/蘇胺酸蛋白激酶可使自身或底物磷酸化，是細胞生長和增殖的關鍵調(diào)控者，不僅是早期胚胎發(fā)育所必須的，還在多種腫瘤細胞中過表達，參與調(diào)控腫瘤細胞的生長和遷移[2-5]。TRPM7 在頭頸部腫瘤中的研究較少。TRPM7在鼻咽鱗癌中過表達，是鼻咽鱗癌細胞增殖、抗凋亡所必需，并與較差的臨床預后密切相關，是獨立的臨床預后因素，敲除TRPM7可以增強鼻咽鱗癌細胞對放療的敏感性[3,8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌OC2細胞中TRPM7過表達，特異性抑制TRPM7后OC2細胞生長、增殖和遷移能力明顯受抑。因此說明TRPM7離子通道在口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起到重要作用，而抑制該通道可能成為口腔鱗癌新的治療途徑。

那么TRPM7到底通過什么途徑調(diào)控口腔鱗癌細胞的生長、增殖和遷移能力？研究表明TRPM7可通過STAT3、AKT、JAK2/STAT3及Notch等多種信號通路調(diào)控不同腫瘤細胞的增殖和遷移[3,9-10]。本研究顯示，抑制TRPM7可下調(diào)磷酸化AKT以及磷酸化ERK的表達水平，因此推測TRPM7通道可能通過PI3K/AKT和MAPK-ERK途徑對口腔鱗癌細胞系OC2的生長進行調(diào)控，但是還需要進一步驗證。此外，我們還推測TRPM7通道至少通過影響陽離子參與口腔癌的發(fā)生發(fā)展。TRPM7是調(diào)控非興奮性細胞(腫瘤細胞屬非興奮細胞)Ca2+內(nèi)流的關鍵通道[11]。TRPM7和m-鈣激活蛋白酶共存于細胞黏附復合體中，Ca2+可通過TRPM7通道激活m-鈣激活蛋白酶，使細胞黏附復合物解離從而抑制細胞黏附[12]。TRPM7 Ca2+通道參與人鼻咽癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。細胞外Ca2+螯合劑、TRPM7抑制劑均可抑制鼻咽癌細胞的遷移，而運用TRPM7 活化劑則促進細胞增殖[13]。在頭頸部腫瘤細胞FaDu和FCC25內(nèi)檢測到Ca2+傳感電流和TRPM7 通道，這種電流至少部分通過 TRPM7通道[14]。我們的膜片鉗技術檢測結(jié)果顯示在TRPM7過表達的OC2細胞中TRPM7樣電流激活，采用TRPM7通道抑制劑2-APB 阻斷TRPM7通道后電流明顯減弱，而采用TRPM7通道活化劑Bradykinin后，電流明顯增強。

綜上所述，TRPM7在口腔鱗癌細胞OC2中過表達，抑制TRPM7離子通道可抑制腫瘤細胞增殖和遷移，可能通過影響PI3K/AKT和MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導途徑以及陽離子內(nèi)流發(fā)揮作用，靶向TRPM7離子通道可能為口腔鱗癌新的治療途徑。

[1] Yee NS, Kazi AA, Yee RK. Cellular and developmental biology of TRPM7 channel-kinase: Implicated roles in cancer[J]. Cells, 2014, 3(3): 751-777.

[2] Gautier M, Perrière M, Monet M, et al. Recent advances in oncogenic roles of the TRPM7 chanzyme[J]. Curr Med Chem, 2016, 23(36): 4092-4107.

[3] Qin Y, Liao ZW, Luo JY, et al.Functional characterization of TRPM7 in nasopharyngeal carcinoma and its knockdown effects on tumorigenesis[J]. Tumour Biol, 2016, 37(7): 9273-9283.

[4] Yee NS, Kazi AA, Li Q, et al. Aberrant over-expression of TRPM7 ion channels in pancreatic cancer: Required for cancer cell invasion and implicated in tumor growth and metastasis[J]. Biol Open, 2015, 4(4): 507-514

[5] Wang J, Liao QJ, Zhang Y, et al. TRPM7 is required for ovarian cancer cell growth, migration and invasion[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 454(4): 547-553

[6] Santoni G, Farfariello V, Amantini C. TRPV channels in tumor growth and progression[J]. Adv Exp Med Biol, 2011, 704: 947-967.

[7] Jin J, Wu LJ, Jun J, et al. The channel kinase, TRPM7, is required for early embryonic development[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(5): E225-233.

[8] Chen JP, Wang J, Luan Y, et al.TRPM7 promotes the metastatic process in human nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Lett, 2015, 356(2 Pt B): 483-490.

[9] Wang J, Liao QJ, Zhang Y, et al.TRPM7 is required for ovarian cancer cell growth, migration and invasion[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 454(4): 547-553.

[10]Liu M, Inoue K, Leng T, et al. TRPM7 channels regulate glioma stem cell through STAT3 and Notch signaling pathways[J]. Cell Signal, 2014, 26(12): 2773-2781.

[11]Prevarskaya N, Skryma R, Shuba Y. Calcium in tumour metastasis: New roles for known actors[J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(8): 609-618.

[12]Su LT, Agapito MA, Li M, et al. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain[J]. J Biol Chem, 2006, 281(16): 11260-11270.

[13]Chen JP, Luan Y, You CX, et al.TRPM7 regulates the migration of human nasopharyngeal carcinoma cell by mediating Ca(2+) influx[J]. Cell Calcium, 2010, 47(5): 425-432.

[14]Jiang J, Li MH, Inoue K, et al. TRPM7-like current in human head and neck carcinoma cells: Role in cell proliferation[J]. Cancer Res, 2007， 67(22): 10929-10938.

TheroleofTRPM7ionchannelintheproliferationandmigrationoforalsquamouscancercells

HANSheng1,CHENYan2.

1. 710032Xi'an,StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology&NationalClinicalResearchCenterforOralDiseases,DepartmentofInformationCenter,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,China; 2.DepartmentofOncology,Xi'jingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an

Objective: To investigate the role of the transient receptor potential melastatin subfamily member 7(TRPM7) ion channel in the proliferation and migration of oral squamous cancer cells OC2.MethodsThe expression of TRPM7 in OC2 cells was examined by western blotting, RT-PCR and indirect immunofluorescence assay. The influence of TRPM7 on cell proliferation and migration under the inhibition of TRPM7 ion channel with 2-APB or siRNA TRPM7 in OC2 cells was examined by MTT and Transwell respectively. The influence of PI3K/AKT signal pathway on the expression of TRPM7 in OC2 cells was tested by Western blotting. The change of positive ion current when the OC2 cells were treated with TRPM7 inhibitor and activator was explored with patch clamp technique.ResultsTRPM7 overexpression in OC2 cells mainly in the cytoplasm was observed, siRNA TRPM7 downregulated the expression of TRPM7. Inhibition of TRPM7(2-APB or siRNA TRPM7) inhibited the growth and proliferation of OC2 cells in a time- and dose-dependent manner. Blockage of TRPM7 ion channel inhibited the migration capacity of OC2 cells. Inhibition of TRPM7 downregulated the expression of phosphorylated AKT and phosphorylated ERK. Patch clamp assay showed the activation of TRPM7-like current in OC2 cells. 2-APB could weaken this current while Bradykinin could enhance the current.ConclusionTRPM7 may regulate the proliferation and migration of oral cancer cells by the regulation of PI3K/AKT and MAPK/ERK signal pathways and cell positive current.

Oralsquamouscellcarcinoma;TRPM7;Cellproliferation;Migration

陜西省攻關項目資助(編號： 2013K12-03-01)； 中華醫(yī)學會吳階平醫(yī)學基金(編號： 320.6750.12235)

710032 西安， 軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室， 口腔疾病國家臨床醫(yī)學研究中心, 第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院信息科(韓晟)； 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院腫瘤科(陳衍)

陳衍 E-mail： chenyan@fmmu.edu.cn

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.022

(收稿： 2016-12-07 修回： 2017-01-04)