宋巖 吳高義 王菁 陳磊 杜曉媛 邢曉濤 鄒姣姣 朱國(guó)雄

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)不同鈦表面骨髓間充干細(xì)胞成骨分化的影響

宋巖 吳高義 王菁 陳磊 杜曉媛 邢曉濤 鄒姣姣 朱國(guó)雄

目的觀(guān)察低強(qiáng)度脈沖超聲(LIPUS)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在鈦片表面成骨分化的影響。方法將體外培養(yǎng)的BMSCs分別接種于光滑鈦表面和大顆粒噴砂酸蝕(SLA)鈦表面，進(jìn)行礦化誘導(dǎo)并實(shí)施超聲干預(yù)和假刺激。于礦化誘導(dǎo)后3、7 d進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)定量檢測(cè)，14 d進(jìn)行ALP染色觀(guān)察；礦化誘導(dǎo)21 d后行茜素紅染色；于礦化誘導(dǎo)14、21 d檢測(cè)成骨相關(guān)基因及蛋白表達(dá)。結(jié)果礦化誘導(dǎo)后3、7 d超聲組ALP活性較對(duì)照組高(P<0.05)，14 d超聲組與對(duì)照組相比鈦片表面ALP染色明顯深染；茜素紅染色顯示，21 d后超聲組的染色更明顯且形成更多的礦化結(jié)節(jié)；超聲組的成骨相關(guān)蛋白成骨轉(zhuǎn)錄因子2、骨形成蛋白、骨橋蛋白表達(dá)增高；RT-PCR檢測(cè)到成骨相關(guān)基因、ALP、成骨轉(zhuǎn)錄因子2、骨形成蛋白、骨橋蛋白、骨鈣素、Ⅰ型膠原蛋白均有不同程度表達(dá)增高(P<0.05)。結(jié)論LIPUS可以促進(jìn)光滑及SLA鈦表面BMSCs的成骨分化。

低強(qiáng)度脈沖超聲(LIPUS)； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)； 成骨分化; 鈦表面

隨著口腔種植技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的焦點(diǎn)集中于如何縮短種植體的骨結(jié)合周期以及擴(kuò)大種植修復(fù)的適應(yīng)證[1-2]。低強(qiáng)度脈沖超聲(LIPUS)是一種安全、無(wú)創(chuàng)的治療手段，依靠超聲波能量作用于組織，能有效起到促進(jìn)組織再生修復(fù)的效果[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是具有多向分化潛能的干細(xì)胞，其在種植體骨結(jié)合方面扮演著重要角色[4-5]。本研究旨在探討LIPUS作用于鈦表面生長(zhǎng)的BMSCs，觀(guān)察其對(duì)BMSCs在鈦表面骨向分化的影響以及不同鈦表面BMSCs對(duì)超聲作用的生物學(xué)行為的差異。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

Wistar大鼠(山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，鈦片(西北有色金屬研究所)，低糖DMEM、DMEM/F12(Gibco，美國(guó))，胎牛血清(Hyclone,美國(guó))，抗壞血酸(a7631)、β甘油磷酸鈉(g9422)、地塞米松(D4902，sigma， 美國(guó))，Runx2一抗(CST，#12556)，BMP2一抗(ab6285)、Osteopontin一抗(ab91655，Abcam，英國(guó))，堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(A059-2，南京建成)，堿性磷酸酶(碧云天)，茜素紅(索萊寶)，超聲治療儀(Cosmogamma US13)，掃描電鏡(S-4800，日立，日本)，體式顯微鏡(SMZ745T，尼康，日本)，酶標(biāo)儀(Thermo scientific，美國(guó))等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs提取和原代培養(yǎng) 選用70～80 g左右wistar大鼠，過(guò)量水合氯醛處死，取其股骨并剔除肌肉組織，減去兩側(cè)骨骺，PBS沖洗骨髓腔，加入10%血清和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液1 次，10 d左右傳代。

1.2.2 BMSCs成骨誘導(dǎo) 配制含0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸的成骨誘導(dǎo)劑，加入含10%血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基。取P3代細(xì)胞以2×104/ml的密度接種細(xì)胞，接種2 d后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，3 d換液1 次。

1.2.3 鈦試件的制備和觀(guān)察 將鈦片切割成10 mm×10 mm×1.0 mm和20 mm×20 mm×1.0 mm的樣本，20 mm×20 mm×1.0 mm試件用于RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)，其他實(shí)驗(yàn)使用10 mm×10 mm×1.0 mm試件，光滑鈦表面試件使用碳化硅砂紙逐級(jí)拋光至1 500目。用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗 10 min，干燥。大顆粒噴砂酸蝕鈦表面在以上處理后，使用筆式噴砂機(jī)和250 μm粒度氧化鋁對(duì)鈦試件噴砂，清洗后置入酸蝕液(180 ml/L HCl：490 ml/L H2SO4=1∶1)中，80 ℃下酸蝕30 min，清洗，干燥。掃描電鏡觀(guān)察鈦表面。

1.2.4 LIPUS處理 將試件分為4 組(n=5)，光滑鈦表面組(FLAT組)、光滑鈦表面超聲組(Flat/LIPUS組)、大顆粒噴砂鈦表面組(SLA組)、大顆粒噴砂鈦超聲組(SLA/LIPUS組)在成骨誘導(dǎo)后行超聲刺激或假刺激。超聲強(qiáng)度：100 mW/cm2，頻率：1.0 MHz，空占比：10%，作用時(shí)間：10 min/d。

1.2.5 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè) P3代細(xì)胞以2×104/ml的密度接種于鈦試件，成骨誘導(dǎo)后超聲干預(yù)，誘導(dǎo)3、7 d后吸取培養(yǎng)液，離心后取上清加入檢測(cè)試劑，酶標(biāo)儀520 nm檢測(cè)吸光度A值，根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算ALP活性(金氏單位/100 ml)=(測(cè)定A值-空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.02 mg/ml)×100 ml×樣品測(cè)定前稀釋倍數(shù)。

1.2.6 ALP染色 細(xì)胞培養(yǎng)和超聲處理同前，14 d終止培養(yǎng)，PBS清洗后4%多聚甲醛固定，根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入染色液，避光孵育1 h，蒸餾水洗滌，體式顯微鏡觀(guān)察。

1.2.7 茜素紅染色 細(xì)胞培養(yǎng)和超聲處理同前，21 d終止培養(yǎng)，PBS清洗后4%多聚甲醛固定，加入0.1%茜素紅溶液，37 ℃孵育3 h，清洗后置于體式顯微鏡觀(guān)察。

1.2.8 Western blot 細(xì)胞培養(yǎng)和超聲處理同前，分別于14 d和21 d終止培養(yǎng)后提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，配制SDS-PAGE，上樣后電泳，電泳完畢將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，孵育二抗1 h，顯色，拍照。

1.2.9 RT-PCR 細(xì)胞培養(yǎng)和超聲處理同前，分別于14 d和21 d終止培養(yǎng)，使用Trizol法提取RNA，測(cè)量RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)溫度為95 ℃，40 個(gè)周期，反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graph Pad Prism 5。引物見(jiàn)表 1。

表 1 引物序列列表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后進(jìn)行方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在原代早期呈鳥(niǎo)嘴形和短梭形為主(圖 1A)，在細(xì)胞增殖后細(xì)胞逐漸呈長(zhǎng)梭形并呈旋渦狀生長(zhǎng)。在傳代后細(xì)胞形態(tài)逐漸穩(wěn)定，細(xì)胞均一性高，背景干凈(圖 1B)。

A: 原代BMSCs; B: 第3代BMSCs

2.2 鈦試件SEM觀(guān)察

光滑鈦表面在掃描電鏡下觀(guān)察表面呈微米級(jí)溝紋結(jié)構(gòu)(圖 2A)，大顆粒噴砂鈦表面表面呈大小不等的微孔結(jié)構(gòu)(圖 2B)。

2.3 ALP活性檢測(cè)

在成骨誘導(dǎo)3 d和7 d，培養(yǎng)液上清行ALP活性檢測(cè)，在誘導(dǎo)3 d時(shí)SLA/LIPUS組中活性升高趨勢(shì)明顯(P<0.01)。在誘導(dǎo)7 d時(shí)超聲組ALP活性較對(duì)照組均有明顯升高(P<0.05)(圖 3)。

A: 光滑鈦表面; B: 大顆粒噴砂酸蝕(SLA)鈦表面

圖 2 鈦試件表面特征(SEM)

A: Flat surface; B: SLA treated surface

Fig 2 The surface characteristics of titanium specimens (SEM)

圖 3 ALP定量檢測(cè)

2.4 ALP染色觀(guān)察

成骨誘導(dǎo)2 周后ALP染色，在經(jīng)過(guò)超聲處理后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組均有更深的染色(圖 4)。

圖 4 成骨誘導(dǎo)2 周ALP染色

2.5 茜素紅染色

成骨誘導(dǎo)3 周后茜素紅染色，F(xiàn)lat/LIPUS組較Flat組的染色更深，出現(xiàn)更多的礦化結(jié)節(jié)(圖 5)。在SLA/LIPUS組的茜素紅染色較SLA組顏色更深。

圖 5 成骨誘導(dǎo)3 周茜素紅染色

2.6 Western Blot結(jié)果

分別于成骨誘導(dǎo)2 周和3 周提取總蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)，OPN、BMP2、Runx2的實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組均有明顯變化(圖 6)。

圖 6 成骨誘導(dǎo)2 周和3 周western blot結(jié)果

Fig 6 Results of western blot after osteogenic induction for 2 and 3 weeks

2.7 RT-PCR結(jié)果

ALP基因在成骨誘導(dǎo)2 周時(shí)，LIPUS組較對(duì)照組表達(dá)增高(P<0.05)，顯示在誘導(dǎo)3 周時(shí)，F(xiàn)LAT/LIPUS組較FLAT組基因表達(dá)降低(P<0.05)。OCN基因在誘導(dǎo)2 周和3 周時(shí)LIPUS組較對(duì)照組增高(P<0.05)，F(xiàn)LAT/LIPUS組在誘導(dǎo)3 周時(shí)尤為明顯(P<0.01)。OPN基因在誘導(dǎo)2周和3周時(shí)LIPUS組較對(duì)照組增高(P<0.05)，F(xiàn)LAT/LIPUS組在誘導(dǎo)3 周時(shí)OPN增高明顯(P<0.01)。在誘導(dǎo)2 周和3 周后BMP2基因表達(dá)LIPUS組較對(duì)照組增高(P<0.05),在成骨誘導(dǎo)2 周時(shí)，LIPUS組Runx2表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，誘導(dǎo)3 周時(shí)FLAT/LIPUS組基因表達(dá)較Flat組表達(dá)升高(P<0.05)。Col-1基因在成骨誘導(dǎo)2 周和3 周時(shí)，LIPUS組較對(duì)照組明顯增高，尤其FLAT/LIPUS組較Flat組升高更為明顯。LIPUS組較對(duì)照組Col-1基因表達(dá)明顯升高(P<0.01)(圖 7)。

3 討 論

超聲是一種安全、無(wú)創(chuàng)的治療方法，大量的動(dòng)物和臨床研究研究表明頻率為0.5～1.5 MHz，強(qiáng)度為30～200 mW/m2的超聲干預(yù)會(huì)促進(jìn)骨組織的愈合、骨沉積和生長(zhǎng)[6-7]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，超聲刺激能上調(diào)間BMSCs中成骨標(biāo)志物和骨基質(zhì)蛋白的表達(dá)，增加成骨細(xì)胞的形成。鈦具有良好的生物相容性和良好的機(jī)械性能，被廣泛應(yīng)用于種植體的制造，機(jī)械拋光表面和大顆粒噴砂酸蝕表面是目前應(yīng)用廣泛的鈦表面。Liu等[8]在新西蘭兔植入植體后使用超聲干預(yù)，結(jié)果顯示超聲縮短了骨結(jié)合出現(xiàn)的時(shí)間并形成更成熟的骨組織。Wu等[9]在放射性骨髓炎犬模型上植入植體并行超聲刺激后發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果。Ganzorig等[10]在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，超聲放射可以增加不同金屬材料上成骨前體細(xì)胞ALP的分泌。

圖 7 成骨誘導(dǎo)2 周和3 周成骨相關(guān)基因的表達(dá)

Fig 7 Expression of osteogenic related genes after osteogenic induction for 2 and 3 weeks

本實(shí)驗(yàn)中使用超聲對(duì)鈦表面上生長(zhǎng)的BMSCs進(jìn)行干預(yù)，觀(guān)察其對(duì)成骨分化的影響。ALP在細(xì)胞成為前成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)，ALP活性被作為成骨細(xì)胞分化的標(biāo)記[11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)ALP活性以及ALP基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行染色觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)超聲組ALP活性相比于參照組有明顯增高。但在21 d時(shí)，RT-PCR顯示超聲組較對(duì)照組表達(dá)呈降低趨勢(shì)，因?yàn)锳LP是成骨早期的代表標(biāo)記，在骨成熟礦化期，由于基質(zhì)中骨鈣素等與羥磷灰石沉積相關(guān)的基因表達(dá)增加，ALP活性下降。所以猜測(cè)實(shí)驗(yàn)組的成骨成熟ALP下降。在21 d的茜素紅染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一猜想，超聲組茜素紅深染且出現(xiàn)更多的礦化結(jié)節(jié)，而細(xì)胞礦化是新生骨生成的重要標(biāo)志。

OCN和OPN作為非膠原蛋白是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志，OCN分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中與鈣磷離子結(jié)合形成羥基磷灰石，OPN蛋白在細(xì)胞黏附和礦化中起重要作用[12-13]，在RT-PCR檢測(cè)中，超聲組OCN和OPN表達(dá)增強(qiáng)，在21 d時(shí)，超聲組OCN和OPN表達(dá)增強(qiáng)趨勢(shì)尤為明顯。在Western blot檢測(cè)中OPN蛋白的表達(dá)與RT-PCR的結(jié)果相吻合。BMP-2屬于TGF-β超家族，可以通過(guò)激活BMP/Smad信號(hào)通路引起下游Runx2的表達(dá)[14]。研究中超聲組BMP-2和RUNx2表達(dá)均成上升趨勢(shì)，尤其Runx2在14 d時(shí)表達(dá)增強(qiáng)趨勢(shì)明顯，而21 d時(shí)較14 d時(shí)趨勢(shì)下降但仍然高于對(duì)照組。Col-1在成骨細(xì)胞表型的發(fā)展和平衡中起重要作用，它可以促進(jìn)種植體與骨組織的整合，其含量反映了骨成熟程度，在RT-PCR檢測(cè)顯示超聲組Col-1表達(dá)較對(duì)照組升高明顯。

在本實(shí)驗(yàn)中選用2 種鈦表面，LIPUS對(duì)2 種鈦表面促進(jìn)成骨方面未見(jiàn)明顯差異，但SLA表面相比于光滑鈦表面，早期礦化及成骨相關(guān)指標(biāo)均高。研究表明鈦材表面的微結(jié)構(gòu)可以增加成骨相關(guān)因子的分泌并增加成骨相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)[15-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前研究結(jié)果相同，而SLA組在超聲刺激下成骨相關(guān)因素的增長(zhǎng)率普遍比光滑鈦表面高，我們認(rèn)為是SLA鈦表面的微結(jié)構(gòu)增加了材料表面積，從而增加了對(duì)超聲刺激能量的吸收。

通過(guò)LIPUS對(duì)鈦表面生長(zhǎng)的BMSCs的早期和后期礦化的影響，發(fā)現(xiàn)LIPUS可以促進(jìn)BMSCs在鈦表面的成骨分化，縮短分化時(shí)間，為L(zhǎng)IPUS應(yīng)用于種植治療領(lǐng)域，縮短治療時(shí)間，提高不良種植病例的種植成功率提供基礎(chǔ)理論。

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TheeffectsoflowintensitypulsedultrasoundontheosteogeneticdifferentiationofBMSCsontitaniumwithdifferentsurfacetopography

SONGYan1,WUGaoyi2,WANGJing2,CHENLei2,DUXiaoyuan3,XINGXiaotao1,ZOUJiaojiao1,ZHUGuoxiong2.

1. 250000,JinzhouMedicalUniversityPostgraduateCultureBaseinGeneralHospitalofJinanMilitaryCommand,China; 2.DepartmentofStomatology,JinanGeneralMilitaryHospital; 3.DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity

Objective: To observe the effects of low intensity pulsed ultrasound(LIPUS) on the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)on titanium surface.MethodsBMSCs from Wistar rat bone marrow were respectively cultured on the flat titanium surface and the large grain blast acid etched(SLA) titanium surface, and induced by mineralization medium. Then, the cells were interfered by LIPUS and a control condition. Alkaline phosphatase(ALP) were quantitative determinated after 3 and 7 d mineralization induction respectively, ALP staining were observed after 14 d induction. Alizarin red staining were observed after 21 d mineralization induction. Osteogenic related protein and gene expressions were detected after mineralization induction.ResultsALP in culture medium of LIPUS group was higher than that of the control group after 3 d and 7 d mineralization induction(P<0.05). LIPUS group showed stronger ALP staining and alizarin staining, and more mineralized nodules than control group. The expression of osteogenic related proteins, including Runx2, BMP2, OPN in LIPUS group increased. Osteogenic related genes expression, including ALP, Runx2, BMP2, OPN, OCN and Col-1 of the LIPUS group increased.ConclusionThe osteogenic differentiation of BMSCs on the flat titanium surface or SLA titanium surface can be promoted by LIPUS.

LowintensityPulseultrasound(LIPUS);Bonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs);Osteogeneticdifferentiation；Titaniumsurface

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)： 61471384， 81400573)； 全軍衛(wèi)生孵育計(jì)劃(編號(hào)： 15QNP019)； 山東省科技發(fā)展計(jì)劃(編號(hào)： 2014GSF118101)； 濟(jì)南市青年科技明星計(jì)劃(編號(hào)： 2013032)

250000， 錦州醫(yī)科大學(xué)濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地(宋巖 邢曉濤 鄒姣姣)； 濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院口腔科(吳高義 王菁 陳磊 朱國(guó)雄)； 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科(杜曉媛)

朱國(guó)雄 E-mail: jnjqzgx@163.com

R329.28

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.001

(收稿： 2016-12-21 修回： 2017-01-13)