林 欣 何 杰 魏 芳 趙 沖 曾利紅 吳 瓊 黃惠康 杜艷蕾 王 紅

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 廣州消化疾病中心(510180)

具核梭桿菌通過(guò)調(diào)控miR-181b在結(jié)腸癌細(xì)胞中形成炎性微環(huán)境的機(jī)制

林 欣 何 杰 魏 芳 趙 沖 曾利紅 吳 瓊 黃惠康 杜艷蕾 王 紅*

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科廣州消化疾病中心(510180)

具核梭桿菌； miR-181b； 腫瘤壞死因子α； 結(jié)直腸腫瘤

腸道菌群在結(jié)直腸癌發(fā)病中的作用日益受到關(guān)注。Mira-Pascual等[1]發(fā)現(xiàn)腺瘤和結(jié)直腸癌黏膜的菌群結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照明顯不同，其中結(jié)直腸癌組具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum，F(xiàn)n)和腸桿菌數(shù)量顯著增多。目前發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的病原菌可能包括Fn、致病性大腸桿菌、產(chǎn)毒性脆弱擬桿菌等[2]。Strauss等[3]發(fā)現(xiàn)IBD患者腸黏膜中Fn呈高豐度，提示Fn可能在炎癥相關(guān)的結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在移植瘤ApcMin/+小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n具有募集髓樣腫瘤免疫細(xì)胞的能力，能形成炎性微環(huán)境[4]。炎性微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，炎性因子介導(dǎo)的信號(hào)通路或許參與腫瘤細(xì)胞的惡性演進(jìn)，認(rèn)識(shí)并深入了解炎性微環(huán)境的調(diào)控機(jī)制尤為重要。

最近一項(xiàng)研究[5]表明，在Fn刺激巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過(guò)程中，可誘導(dǎo)產(chǎn)生某些miRNA，通過(guò)增加炎性因子水平來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對(duì)病原體反應(yīng)的能力。然而在腸道炎癥反應(yīng)過(guò)程中起重要作用的miRNA尚不清楚。人miRNA-181基因由miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b-2、miR-181b-2、miR-181c和miR-181d組成[6]，是一個(gè)重要的基因表達(dá)調(diào)控因子[7]，近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a在單核巨噬細(xì)胞中能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，與炎癥因子呈負(fù)相關(guān)[8]。然而，F(xiàn)n是否通過(guò)miR-181發(fā)揮作用，以及結(jié)腸癌細(xì)胞形成炎性微環(huán)境的機(jī)制尚不明確。miR-181與其靶基因在結(jié)直腸癌中可能參與的信號(hào)通路尚待研究。本研究通過(guò)構(gòu)建Fn感染結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞炎癥模型，并運(yùn)用miRNA測(cè)序技術(shù)找出差異表達(dá)的miRNA，旨在探討結(jié)腸癌細(xì)胞形成炎性微環(huán)境的可能機(jī)制，為研究結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、菌株、細(xì)胞株和主要試劑

1.菌株：Fn標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 10953購(gòu)自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

2.細(xì)胞株：人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞株Caco-2購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。人淋巴細(xì)胞由廣州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科健康志愿者全血樣本中獲取并簽署知情同意書(shū)，研究方案通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

3.主要試劑：psiCHECKTM-2載體(Promega公司)。染料法Hairpin-it hsa-miR-181b-5p定量和U6校準(zhǔn)qRT-PCR試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，miR-181b mimics、inhibitor模擬物以及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照RNA(蘇州吉瑪基因股份有限公司)。RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、qPCR試劑(日本TAKARA公司)，LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)，TNF-α抗體、β-actin抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(Abcam公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Science有限公司)，人淋巴細(xì)胞分離液Histopaque?-1077(Sigma公司)，ECL試劑盒(Millipore公司)。

二、研究方法

1.細(xì)菌培養(yǎng)：取Fn菌株在哥倫比亞血平板上劃線，37 ℃孵箱厭氧培養(yǎng)48 h至單個(gè)菌落明顯可見(jiàn)。鑒定、傳代，挑取單個(gè)菌落接種至含BHI培養(yǎng)基的無(wú)菌離心管中，37 ℃孵箱厭氧培養(yǎng) 24 h，使細(xì)菌處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，制備細(xì)菌懸液。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和分組：Caco-2細(xì)胞以含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106～2×106/個(gè)，接種于6孔板，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2環(huán)境中。待細(xì)胞貼壁融合度達(dá)80%時(shí)，棄培養(yǎng)基，按照MOI=200∶1(細(xì)菌∶細(xì)胞)，處理組細(xì)胞中加入Fn菌體懸液(2×108～4×108CFU)，對(duì)照組以相應(yīng)體積培養(yǎng)基替代，培養(yǎng)6 h后收集樣本。

3.miRNA測(cè)序：收集細(xì)胞裂解樣本，送廣州市銳博生物科技有限公司行miRNA測(cè)序。

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：Fn感染Caco-2細(xì)胞接種于6孔板，將轉(zhuǎn)染試劑分別與200 pmol/孔miR-181b mimics和inhibitor混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后細(xì)胞換液，48 h后收集上清，收集細(xì)胞提取總RNA或總蛋白。

5.qRT-PCR法：取各組細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。TNF-α引物上游：5’-CCT CCT CTC TGC CAT CAA GA-3’，下游：5’-CTG AGT CGG TCA CCC TTC TC-3’。以β-actin作為內(nèi)參，引物上游：5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，下游：5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。每個(gè)樣本設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)。

6.ELISA法：取各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，1 000×g室溫離心20 min，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液中TNF-α含量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.蛋白質(zhì)印跡法：取各組細(xì)胞，以蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入TNF-α一抗(工作濃度1∶2 500)、β-actin一抗(工作濃度1∶10 000)4 ℃孵育過(guò)夜。加入二抗室溫孵育1 h，ECL法顯影。凝膠圖像處理系統(tǒng)行灰度掃描，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

8.淋巴細(xì)胞提?。撼槿〗】抵驹刚呖鼓?，以RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶1稀釋。加入淋巴細(xì)胞分離液，400×g室溫離心30 min。吸取上、中層界面處一白色云霧層狹窄帶，加入RPMI-1640培養(yǎng)基，離心。末次離心后，棄上清，加入RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。適當(dāng)稀釋后，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

9.Transwell小室法：水化小室，37 ℃孵箱培養(yǎng)1 h。分別設(shè)置細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組，將對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基加入至下室，小室加入1.5×105個(gè)/孔人淋巴細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 4 h。取出小室，洗滌，固定，染色，透明，封片。光學(xué)顯微鏡下閱片，每個(gè)小室膜隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，計(jì)數(shù)所有穿膜淋巴細(xì)胞數(shù)，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、Fn感染Caco-2細(xì)胞可釋放炎性因子、招募淋巴細(xì)胞

與共培養(yǎng)前細(xì)胞相比，與Fn共培養(yǎng)6 h后細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)胞膜受到破壞，細(xì)胞間聯(lián)系疏松不緊密(圖1A)。

與對(duì)照組相比，F(xiàn)n組炎性因子TNF-α、IL-1β、RELM-β mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖1B)。Fn組TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖1B、1C)，培養(yǎng)上清液中TNF-α含量亦顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(圖1D)。

Transwell小室結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和Fn組穿膜淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著增高(P<0.05)(圖1E)。提示含有TNF-α的Fn與細(xì)胞共培養(yǎng)上清可募集淋巴細(xì)胞。另一方面，該現(xiàn)象進(jìn)一步驗(yàn)證了Fn感染Caco-2細(xì)胞炎癥模型的可靠性。

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

A：Fn感染Caco-2細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變；B：Fn感染Caco-2細(xì)胞中炎性因子mRNA表達(dá)(qRT-PCR法)；C：TNF-α蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；D：上清液中TNF-α含量(ELISA法)；E：穿膜淋巴細(xì)胞數(shù)量(Transwell小室法，×400)

圖1 Fn感染Caco-2細(xì)胞可釋放炎性因子、招募淋巴細(xì)胞

二、Fn感染Caco-2細(xì)胞抑制miR-181b表達(dá)

miRNA測(cè)序結(jié)果顯示Fn組miR-181b表達(dá)顯著低于對(duì)照組(表1)。qRT-PCR法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n組miR-181b表達(dá)顯著低于對(duì)照組(t=5.390，P=0.001 0)(圖2)。

表1 兩組間miR-181b表達(dá)的miRNA測(cè)序結(jié)果

圖2 Fn感染Caco-2細(xì)胞可抑制miR-181b表達(dá)(qRT-PCR法)

三、Fn通過(guò)抑制miR-181b表達(dá)上調(diào)TNF-α

與對(duì)照組相比，miR-181b mimics+Fn組TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，上清液中TNF-α含量亦顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明miR-181b表達(dá)與TNF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖3)。

四、TNF-α為miR-181b的靶基因

miR-181b inhibitor組TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，上清液中TNF-α含量亦顯著升高(P<0.05)(圖4A～4C)。進(jìn)一步說(shuō)明miR-181b與TNF-α呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。

使用三種生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-181b-5p種子區(qū)與TNF-α 3’UTR有結(jié)合位點(diǎn)，且位點(diǎn)一致(圖4D)，雙熒光素酶活性檢測(cè)亦證實(shí)兩者的靶標(biāo)關(guān)系(圖4E)。在轉(zhuǎn)染克隆有TNF-α基因3’UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中miR-181b-5p組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028，P=0.016)，說(shuō)明miR-181b-5p能通過(guò)結(jié)合TNF-α基因3’UTR影響其熒光活性改變。在轉(zhuǎn)染克隆有突變型TNF-α基因3’UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR-181b-5p mimics組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明miR-181b-5p不能通過(guò)結(jié)合突變型TNF-α基因3’UTR影響其熒光活性改變，結(jié)合位點(diǎn)突變完全。而miR-181b受到抑制后，在轉(zhuǎn)染克隆有TNF-α基因3’UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR-181b-5p inhibitor組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011，P=0.007)，說(shuō)明miR-181b-5p inhibitor能封閉miR-181b-5p，通過(guò)抑制結(jié)合TNF-α基因3’UTR影響其熒光活性改變。而在轉(zhuǎn)染克隆有突變型TNF-α基因3’UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR-181b-5p inhibitor組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。

五、Fn通過(guò)調(diào)控miR-181b在結(jié)腸癌細(xì)胞中形成炎性微環(huán)境

Fn與過(guò)表達(dá)miR-181b的Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中，穿膜淋巴細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(圖5)。說(shuō)明在Fn感染的情況下，上調(diào)miR-181b表達(dá)能使結(jié)腸癌細(xì)胞中TNF-α表達(dá)降低，降低招募的淋巴細(xì)胞數(shù)。

討 論

Fn是一種具有侵襲性[9]、黏附性[10]的厭氧菌，可釋放促炎因子。Fn相關(guān)結(jié)直腸癌的研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n能通過(guò)自身結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物等組分，刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎性因子，如TNF-α、IL-6、IL-8、PGE2等，從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

A：TNF-α mRNA表達(dá)(qRT-PCR法)；B：上清液中TNF-α含量(ELISA法)；C：TNF-α蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

A：TNF-α mRNA表達(dá)(qRT-PCR法)；B：上清液中TNF-α含量(ELISA法)；C：TNF-α蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；D：三種生物信息學(xué)工具發(fā)現(xiàn)miR-181b與TNF-α結(jié)合位點(diǎn)一致；E：293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組載體和突變體質(zhì)粒后活性比較

圖4 TNF-α為miR-181b的靶基因

圖5 Fn通過(guò)上調(diào)miR-181b表達(dá)降低招募的淋巴細(xì)胞數(shù)(Transwell小室法，×400)

Caco-2細(xì)胞是一種培養(yǎng)達(dá)到融合時(shí)表達(dá)正常腸上皮細(xì)胞分化特征的結(jié)腸癌細(xì)胞，且為合適的轉(zhuǎn)染宿主。Trainer等[13]對(duì)19種結(jié)腸癌細(xì)胞株的致瘤性進(jìn)行分級(jí)，發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞屬于Ⅱ級(jí)結(jié)腸原發(fā)性腺癌細(xì)胞，可形成腺狀和管狀組織結(jié)構(gòu)，并具有分泌黏蛋白以及形成成纖維細(xì)胞的能力，長(zhǎng)期培養(yǎng)后可致腫瘤形成。Caco-2細(xì)胞常用于腸道癌前病變細(xì)胞模型，多項(xiàng)研究[14-17]通過(guò)構(gòu)建Caco-2細(xì)胞模型研究IBD、腺瘤型息肉等疾病，因此本研究選用Caco-2作為細(xì)胞模型。本研究發(fā)現(xiàn)Fn組TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增高，提示Fn能促進(jìn)Caco-2細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)。最近一項(xiàng)研究[18]證實(shí)了ETBF與IL-17結(jié)合能誘導(dǎo)MO-MDSC分化，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。Fn亦具有募集MDSC的能力，可形成腫瘤炎性微環(huán)境而起促癌的作用。

miRNA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期和增殖的調(diào)控具有重要意義。Yang等[19]發(fā)現(xiàn)Fn感染小鼠中miR-21表達(dá)顯著增加。應(yīng)用miR-21抑制劑能抑制與Fn共培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。早期研究顯示某些miRNA由巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對(duì)病原體反應(yīng)的能力，而病原體本身又能反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)[20-21]。Ito等[22]通過(guò)比較腺瘤組織等癌前病變和結(jié)直腸癌組織發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n表達(dá)與miR-31表達(dá)可能存在一定的關(guān)系，但仍需進(jìn)一步明確其關(guān)系。Nosho等[5]認(rèn)為Fn或許能通過(guò)miR-21增加IL-10和PGE2水平，抑制腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答。有研究[23]發(fā)現(xiàn)miR-155能通過(guò)擴(kuò)大炎癥效應(yīng)促進(jìn)腫瘤發(fā)生，在炎癥與癌癥之間起橋梁的關(guān)系。本研究通過(guò)對(duì)細(xì)胞模型行miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n組中miR-181b表達(dá)顯著降低。有研究[24]發(fā)現(xiàn)miR-181b-1受到激活后，能通過(guò)CYLD途徑實(shí)現(xiàn)炎癥-癌變的過(guò)程。提示miR-181b可能在Fn感染Caco-2細(xì)胞導(dǎo)致的炎癥過(guò)程中扮演重要角色，可能是“炎癥-腫瘤”轉(zhuǎn)化過(guò)程中新的節(jié)點(diǎn)miRNA分子。

本研究使用生物信息學(xué)工具檢測(cè)miR-181b與TNF-α的結(jié)合位點(diǎn)，并采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)對(duì)兩者的靶標(biāo)關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α為miR-181b的靶基因，兩者呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。Fn感染能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞中TNF-α表達(dá)，并具有募集淋巴細(xì)胞的能力。抑制細(xì)胞中miR-181b表達(dá)，可誘導(dǎo)TNF-α釋放增多。當(dāng)Fn感染存在的情況下，恢復(fù)細(xì)胞中miR-181b水平，TNF-α表達(dá)依然下調(diào)，miR-181b對(duì)細(xì)胞的內(nèi)在調(diào)控作用起主要的影響。因此，推測(cè)Fn可能通過(guò)抑制miR-181b上調(diào)TNF-α的表達(dá)，從而形成炎性微環(huán)境，最終在Fn感染所致的反復(fù)局部炎癥反應(yīng)過(guò)程中誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Fn感染的結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-181b表達(dá)下降，并通過(guò)靶向調(diào)節(jié)其下游基因TNF-α，招募淋巴細(xì)胞向炎癥部位聚集，形成炎性微環(huán)境，由于反復(fù)炎癥感染的存在，為結(jié)直腸癌的發(fā)生提供了病理生理基礎(chǔ)，提示miR-181b在Fn參與的炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。然而，目前對(duì)Fn誘導(dǎo)miR-181b表達(dá)的機(jī)制尚不明確，且“Fn感染-炎癥-腫瘤”整個(gè)過(guò)程中涉及的關(guān)鍵基因的動(dòng)態(tài)變化仍未完全清楚，有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

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(2017-04-13收稿；2017-05-11修回)

MechanismofFusobacteriumnucleatumviaRegulatingmiR-181bforFormingAnInflammatoryMicroenvironmentinColonCancerCells

LINXin,HEJie,WEIFang,ZHAOChong,ZENGLihong,WUQiong,HUANGHuikang,DUYanlei,WANGHong.

DepartmentofGastroenterology,GuangzhouFirstPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity;GuangzhouDigestiveDiseaseCenter,Guangzhou(510180)

WANG Hong,Email:wong.hong@163.com

Fusobacteriumnucleatum; miR-181b; Tumor Necrosis Factor-alpha; Colorectal Neoplasms

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.10.004

*本文通信作者，Email:wong.hong@163.com

背景：具核梭桿菌(Fn)是口腔常見(jiàn)的致病菌，研究發(fā)現(xiàn)Fn與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，尤其是炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌。目的探討Fn感染在結(jié)腸癌細(xì)胞中形成炎性微環(huán)境的機(jī)制。方法構(gòu)建Fn感染Caco-2細(xì)胞的炎癥模型，行miRNA測(cè)序。將miR-181b mimics或inhibitor轉(zhuǎn)染Fn感染的Caco-2細(xì)胞。以qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)，ELISA法檢測(cè)上清液中TNF-α含量，Transwell小室法檢測(cè)穿膜淋巴細(xì)胞數(shù)。結(jié)果Fn組TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，上清液中TNF-α含量顯著升高(P<0.05)，穿膜淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)。miRNA測(cè)序和qRT-PCR結(jié)果均顯示，F(xiàn)n組miR-181b表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比，miR-181b mimics+Fn組TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；而miR-181b inhibitor組TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。生物信息學(xué)工具和雙熒光素酶檢測(cè)證實(shí)TNF-α可能為Caco-2細(xì)胞中miR-181b的靶基因。結(jié)論Fn通過(guò)抑制Caco-2細(xì)胞中miR-181b表達(dá)而上調(diào)TNF-α表達(dá)，募集淋巴細(xì)胞形成炎性微環(huán)境。

Background:Fusobacteriumnucleatum(Fn) is a common oral pathogen.Studies have shown that Fn is closely related to the occurrence and development of colorectal cancer,especially the inflammation-related colorectal cancer.AimsTo investigate the mechanism of Fn in forming an inflammatory microenvironment in colon cancer cells.MethodsAn inflammation model of Caco-2 cells infected by Fn was constructed,and miRNA sequencing was performed.miR-181b mimics or inhibitor was transfected into Fn infected Caco-2 cells.mRNA and protein expressions of TNF-α were determined by qRT-PCR and Western blotting,respectively,and concentration of TNF-α in supernatant was measured by ELISA,number of lymphocyte penetrating the membrane was measured by Transwell chamber.ResultsCompared with control group,mRNA and protein expressions of TNF-α were significantly increased (P<0.05),concentration of TNF-α in supernatant was significantly increased (P<0.05),and number of lymphocyte penetrating the membrane was significantly increased in Fn group (P<0.05).miRNA sequencing and qRT-PCR results showed that expression of miR-181b was significantly decreased in Fn group than in control group (P<0.05).Compared with control group,mRNA and protein expressions of TNF-α were significantly decreased in miR-181b mimics+Fn group (P<0.05),however,mRNA and protein expressions of TNF-α were significantly increased in miR-181b inhibitor group (P<0.05).Bioinformatics tools and Luciferase assay confirmed that TNF-α might be the target gene of miR-181b in Caco-2 cells.ConclusionsFn can up-regulate the expression of TNF-α by inhibiting miR-181b in Caco-2 cells and recruiting lymphocytes to form an inflammatory microenvironment.