趙博，馬莉，詹麗英，冷燕，袁泉，劉戀

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科,湖北 武漢 430060)

·論 著·

SAFE 通路介導(dǎo)的炎癥因子在大鼠心肌缺血再灌注致腦損傷中的作用

趙博，馬莉，詹麗英，冷燕，袁泉，劉戀

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科,湖北 武漢 430060)

目的探討生存活化因子增強(qiáng)通路(SAFE)介導(dǎo)的炎癥因子在大鼠心肌缺血再灌注致腦損傷中的作用。方法24只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為三組(n=8)：假手術(shù)組(Sham)、心肌缺血/再灌注組(IR)、心肌缺血/再灌注+AG490組(IR+AG490)。IR組及IR+AG490組通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支30 min,再灌注120 min建立大鼠心肌缺血/再灌注模型。取大鼠腦組織,Western blot檢測(cè)Janus激酶2(Jak2)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)蛋白表達(dá)及炎癥因子白介素1(IL-1),白介素6(IL-6),白介素8(IL-8),TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,比色法檢測(cè)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)活性。結(jié)果與Sham組比較,IR組p-Jak2[(1.8±0.13)vs(1.0±0)]、p-STAT3[(1.6±0.08)vs(1.0±0)]表達(dá)增高,炎癥因子IL-1[(3.3±0.16)vs(1.0±0)]、IL-6[(3.3±0.16)vs(1.0±0)]、IL-8[(2.8±0.28)vs(1.0±0)]表達(dá)增多,TUNEL[(18.8±1.29)%vs(4.2±0.44)%]表達(dá)增多,Caspase3活性[(2.6±0.24)vs(1.0±0)]升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與IR組比較,IR+AG490組p-Jak2[(1.3±0.09)vs(1.8±0.13)],p-STAT3[(1.1±0.11)vs(1.6±0.08)]表達(dá)減少,炎癥因子IL-1[(2.1±0.17)vs(3.3±0.16)]、IL-6[(1.9±0.22)vs(3.3±0.16)]、IL-8[(2.2±0.19)vs(2.8±0.28)表達(dá)降低,TUNEL[(13.2±1.03)%vs(18.8±1.29)%]表達(dá)降低,Caspase3活性 [(2.1±0.21)vs(2.6±0.24)]降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論抑制SAFE通路的激活可以降低其下游炎癥因子的級(jí)聯(lián)表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡，減輕大鼠心肌缺血再灌注引起的腦損傷。

生存活化因子增強(qiáng)通路；炎癥因子；心肌缺血再灌注；腦損傷

生存活化因子增強(qiáng)通路(survivor activating factor enhancement，SAFE)作為新近發(fā)現(xiàn)的保護(hù)性通路，是參與炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路之一，其可被多種炎癥因子激活，并參與炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大[1-2]，其中最重要的信號(hào)通路為Jak2/STAT3通路[3]。目前Jak2/STAT信號(hào)通路在心肌缺血再灌注后致腦損傷的作用報(bào)道尚少，本研究擬通過(guò)建立大鼠心肌缺血再灌注模型，探討Jak2/STAT3通路介導(dǎo)的炎癥因子在心肌缺血再灌注后腦損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Jak2特異性抑制劑AG490(Selleck公司，美國(guó))；單克隆抗體Jak2、STAT3、白細(xì)胞介素1，6，8(CST公司，美國(guó))；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(Roche公司，美國(guó))；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(碧云天科技有限公司，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 雄性SD大鼠24只(北京華阜康生物科技股份有限公司，中國(guó))，體質(zhì)量200～220 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham)、心肌缺血/再灌注組(IR)、心肌缺血/再灌注+AG490組(IR+AG490)，每組8只。IR+AG490組在再灌注前20 min靜脈給予Jak2特異性抑制劑AG490。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注模型 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg進(jìn)行麻醉，固定后連接心電導(dǎo)聯(lián)，行氣管插管，呼吸機(jī)機(jī)械通氣，分離股靜脈并置管。開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LDA)，心電圖見(jiàn)到明顯的ST段抬高(＞0.12 mV)，心前區(qū)變白，則認(rèn)為造模成功。結(jié)扎時(shí)間為30 min，松開(kāi)線結(jié)再灌注120 min后取腦組織。再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)：ST段回落，心尖恢復(fù)紅潤(rùn)。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 (1)Western blot法檢測(cè)Jak2、STAT3、IL-1、IL-6、I-L8的表達(dá)：腦組織用裂解液提取蛋白，并測(cè)定蛋白濃度，采用聚丙烯酞胺凝膠電泳分離目的蛋白，冰浴轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉室溫封閉1～2 h，加入單克隆抗體Jak2、STAT3、IL-1、IL-6、IL-8在4℃下?lián)u床孵育過(guò)夜，次日采用熒光二抗孵育1 h后用TBST清洗，應(yīng)用紅外成像系統(tǒng)掃膜，并讀取灰度值，用Odessay軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；(2)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平：制備石蠟切片，H2O2孵育10 min，滴加新鮮稀釋蛋白酶K，消化10 min，加入反應(yīng)混合液，孵育60 min后，加入轉(zhuǎn)化劑，孵育30 min，DAB顯色；(3)比色法檢測(cè)Caspase3活性：提取新鮮腦組織蛋白勻漿制成蛋白懸濁液后，設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白孔，采用Caspase3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase3活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用S-N-K檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌缺血再灌注后腦組織Jak2，STAT3變化 與Sham組比較，IR組腦組織中p-Jak2，p-STAT3的表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與IR組比較，IR+AG490組Jak2，STAT3磷酸化水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 心肌缺血再灌注后腦組織Jak2，STAT3的變化(±s)

表1 心肌缺血再灌注后腦組織Jak2，STAT3的變化(±s)

注：與Sham組比較，aP＜0.05，與IR組比較，bP＜0.05。

?

2.2 心肌缺血再灌注后腦組織炎癥因子變化 IR損傷能引起腦組織炎癥因子釋放水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而心肌缺血再灌注前通過(guò)靜脈給予Jak2抑制劑AG490可減少腦組織IL-1，IL-6，IL-8的表達(dá)和釋放，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 心肌缺血再灌注后腦組織炎癥因子的變化(±s)

表2 心肌缺血再灌注后腦組織炎癥因子的變化(±s)

注：與Sham組比較，aP＜0.05，與IR組比較，bP＜0.05。

?

2.3 心肌缺血再灌注后腦組織凋亡水平 與Sham組比較，IR組TUNEL表達(dá)增多，Caspase3活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與IR組比較，IR+AG490組TUNEL表達(dá)減少低，Caspase3活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 心肌缺血再灌注后腦組織TUNEL及Caspase3的變化(±s)

表3 心肌缺血再灌注后腦組織TUNEL及Caspase3的變化(±s)

注：與Sham組比較，aP＜0.05，與IR組比較，bP＜0.05。

?

3 討 論

再灌注損傷補(bǔ)救激酶通路(reperfusion injury salvage kinases,RISK)與SAFE通路是缺血/再灌注損傷中的重要信號(hào)通路[4-5]，2009年Lecour[6]首次描述了SAFE促生存信號(hào)通路，在該通路中保護(hù)性信號(hào)分子在缺血/再灌注過(guò)程中被激活從而抑制細(xì)胞凋亡減輕組織損傷。Jak2/STAT3通路作為SAFE通路中重要的信號(hào)通路之一，由于介導(dǎo)信號(hào)由細(xì)胞膜向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)[7]，引起研究者的廣泛關(guān)注。

IL-6作為炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素及誘導(dǎo)者，具有催化和放大炎癥反應(yīng)的作用，能直接反映損傷的嚴(yán)重程度。而IL-1可以刺激其它炎癥因子的合成，在病理生理進(jìn)展中起著重要的協(xié)同作用[8-9]。本研究結(jié)果顯示大鼠心肌缺血再灌注后腦組織中的Jak2和STAT3磷酸化程度增高，進(jìn)一步研究顯示大鼠腦組織中炎癥因子IL-1，IL-6，IL-8和凋亡相關(guān)蛋白TUNEL，Caspase3的表達(dá)量亦增高。因此推測(cè)大鼠Jak2/STAT3信號(hào)通路激活加重腦損傷可能與腦組織局部炎癥因子的激活和釋放增加有關(guān)[10]。當(dāng)心肌IR損傷發(fā)生后腦組織的損傷亦明顯增加，其主要表現(xiàn)在組織中凋亡水平和炎性因子的顯著增加[11]。因此推測(cè)炎性因子的激活和釋放可能是心腦同病變的病理生理基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示：在術(shù)前靜脈給予JAK2特異性抑制劑AG490后，抑制劑組腦組織中Jak2/STAT3通路磷酸化降低，炎癥因子釋放減少，細(xì)胞凋亡程度較再灌注組降低。推測(cè)Jak2/STAT3表達(dá)降低可能對(duì)炎癥因子的釋放起到了調(diào)控作用，并通過(guò)調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)減少TUNEL和Caspase3的表達(dá)，從而在多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)Jak2/STAT3作為SAFE通路中的主要信號(hào)通路，其與RISK通路之間可能存在“串話”現(xiàn)象[12]。這種現(xiàn)象可能是導(dǎo)致研究者對(duì)信號(hào)通路傳導(dǎo)研究結(jié)果不一致的可能原因之一。有研究報(bào)道稱STAT3可能是連接PI3K和JAK2的適配器蛋白[13-14]。

綜上所述，在大鼠心肌缺血再灌注引起的腦損傷模型中Jak2/STAT3通路通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的變化，進(jìn)而對(duì)心肌缺血再灌注后腦損傷發(fā)揮作用。Jak2特異性抑制劑AG490通過(guò)抑制炎癥因子的釋放，減輕心肌缺血再灌注所致的腦損傷。

[1]Yu L,Li B,Zhang M,et al.Melatonin reduces PERK-eIF2α-ATF4-mediated endoplasmic reticulum stress during myocardial ischemia-reperfusion injury:role of RISK and SAFE pathways interaction[J].Apoptosis,2016,21(7):809-824.

[2]Penna C,Settanni F,Tullio F,et al.GH-releasing hormone induces cardioprotection in isolated male rat heart via activation of RISK and SAFE pathways[J].Endocrinology,2013;154(4):b1624-1635.

[3]Hu GQ,Du X,Li YJ,et al.Inhibition of cerebral ischemia/reperfusion injury-induced apoptosis:nicotiflorin and JAK2/STAT3 pathway[J].Neural Regen Res,2017,12(1):96-102.

[4]Frias MA,Lecour S,James RW,et al.High density lipoprotein/sphingosine-1-phosphate-induced cardioprotection:Role of STAT3 as part of the SAFE pathway[J].JAKSTAT,2012,ik1(2):92-100.

[5]Hausenloy DJ,Lecour S,Yellon DM.Reperfusion injury salvage kinase and survivor activating factor enhancement prosurvival signaling pathways in ischemic postconditioning:two sides of the same coin[J].Antioxid Redox Signal.2011,14(5):893-907.

[6]Lecour S.Activation of the protective Survivor Activating Factor Enhancement(SAFE)pathway against reperfusion injury:Does it go beyond the RISK pathway?[J]J Mol Cell Cardiol,2009,47(1):32-40.

[7]Luan HF,Zhao ZB,Zhao QH,et al.Hydrogen sulfide postconditioning protects isolated rat hearts against ischemia and reperfusion injury mediated by the JAK2/STAT3 survival pathway[J].Braz J Med Biol Res.2012,45(10):898-905.

[8]Liu T,Fei Z,Gangavarapu KJ,et al.Interleukin-6 and JAK2/STAT3 signaling mediate the reversion of dexamethasone resistance after dexamethasone withdrawal in 7TD1 multiple myeloma cells[J].Leuk Res,2013,37(10):1322-1328.

[9]Jo HA,Kim JY,Yang SH,et al.The role of local IL6/JAK2/STAT3 signaling in high glucose-induced podocyte hypertrophy.Kidney Res Clin Pract,2016,35(4):212-218.

[10]Zhao L,Wu D,Sang M,et al.Stachydrine ameliorates isoproterenol-induced cardiac hypertrophy and fibrosis by suppressing inflammation and oxidative stress through inhibiting NF-κ B and JAK/STAT signaling pathways in rats[J].Int Immunopharmacol,2017,48:102-109.

[11]Harima M,Arumugam S,Wen J,et al.Effect of carvedilol against myocardial injury due to ischemia-reperfusion of the brain in rats[J].Exp Mol Pathol,2015,98(3):558-562.

[12]Marchant DJ,Boyd JH,Lin DC,et al.Inflammation in myocardial diseases[J].Circ Res,2012,110(1):126-144.

[13]Li Y,Shan Z,Liu C,et al.MicroRNA-294 Promotes Cellular Proliferation and Motility through the PI3K/AKT and JAK/STAT Pathways by Upregulation of NRAS in Bladder Cancer[J].Biochemistry(Mosc),2017,82(4):474-482.

[14]Kim MS,Lee WS,Jeong J,et al.Induction of metastatic potential by TrkB via activation of IL6/JAK2/STAT3 and PI3K/AKT signaling in breast cancer[J].Oncotarget,2015,6(37):40158-40171.

Role of inflammatory factor in SAFE pathway on brain injury in rats induced by myocardial ischemia reperfusion.

Z HAO Bo,MA Li,ZHAN Li-ying,LENG Yan,YUAN Quan,LIU Lian.Department of Anesthesiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo evaluate the role of inflammatory factor in survivor activating factor enhancement(SAFE)pathway on brain injury rats induced by myocardial ischemia reperfusion(IR).MethodsTwenty-four male Sprague-Dawley rats were divided into 3 groups by random number table(8 cases in each group):Sham group,IR group,IR+AG490 group.Myocardial IR was induced by occlusion of the anterior descending branch of the left coronary artery for 30 min in IR group and IR+AG490 group.The rats were sacrificed after 120 min of reperfusion and the brain were removed for the check of Janus Kinase 2/Signal Transducer and Activator of Transcription 3(JAK2/STAT3),interleukin-1(IL-1),interleukin-6(IL-6),interleukin-8(IL-8).Apoptosis was detected by TUNEL assay and cysteine-containing aspartic proteolytic enzyme 3(Caspase3)activity was detected by colorimetric assay.ResultsCompared with sham group,p-Jak2[(1.8±0.13)vs(1.0±0)],p-STAT3[(1.6±0.08)vs(1.0±0)],IL-1[(3.3±0.16)vs(1.0±0)],IL-6[(3.3±0.16)vs(1.0±0)],IL-8[(2.8±0.28)vs(1.0±0)],TUNEL[(18.8±1.29)%vs(4.2±0.44)%],Caspase3[(2.6±0.24)vs(1.0±0)]were significantly increased in IR group(P＜0.05);compared with IR group,p-Jak2[(1.3±0.09)vs(1.8±0.13)],p-STAT3[(1.1±0.11)vs(1.6±0.08)],IL-1[(2.1±0.17)vs(3.3±0.16)],IL-6[(1.9±0.22)vs(3.3±0.16)],IL-8[(2.2±0.19)vs(2.8±0.28)],TUNEL[(13.2±1.03)%vs(18.8±1.29)%],Caspase3[(2.1±0.21)vs(2.6±0.24)]were significantly decreased in IR+AG490 group(P＜0.05).ConclusionInhibiting the activation of SAFE pathway can reduce brain injury induced by myocardial IR in rats though decreasing the inflammatory factor of downstream.

Survivor activating factor enhancement(SAFE)pathway;Inflammatory factor;Myocardial ischemia reperfusion;Brain injury

R-332

A

1003—6350（2017）20—3269—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.20.001

湖北省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2016CFB167，2017CFB267)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金(編號(hào)：2042017kf0147)

趙博。E-mail：zb14526@163.com

2017-04-03)