周建中 高 蕾 陶永霞 張 暉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院1，烏魯木齊 830052)(江南大學(xué)食品學(xué)院2，無錫 214122)

中性條件下棉籽球蛋白熱聚集體的形成及其溶解性的研究

周建中1高 蕾1陶永霞1張 暉2

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院1，烏魯木齊 830052)(江南大學(xué)食品學(xué)院2，無錫 214122)

針對棉籽蛋白溶解度不佳，難以在食品工業(yè)中開發(fā)利用的問題，以棉籽球蛋白中最重要的組成成分棉籽7S 和12S球蛋白為原料，在中性條件下分別誘導(dǎo)其形成聚集體，并對其聚集體的形貌特征進(jìn)行了分析表征；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對熱聚集體的溶解性質(zhì)進(jìn)行了分析。闡述棉籽蛋白溶解性與聚集行為之間的關(guān)系，結(jié)果表明12S球蛋白的溶解度隨著加熱溫度的升高呈現(xiàn)出先略微增高而后下降的趨勢，可認(rèn)為其生成的是不可溶性聚集體，而7S球蛋白隨著加熱溫度的升高，依然保持了較高的溶解度，可認(rèn)為其生成的為可溶性聚集體。該研究為進(jìn)一步提高棉籽蛋白制品的品質(zhì)以及對其開發(fā)、利用提供借鑒。

棉籽球蛋白 熱聚集體 結(jié)構(gòu)表征 溶解性

在食品的加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^程中，蛋白質(zhì)的聚集不可避免，但此前，聚集體對食品品質(zhì)影響的研究卻十分缺乏[1]。蛋白質(zhì)的熱聚集是指蛋白質(zhì)在加熱條件下發(fā)生的解離或聚合現(xiàn)象。只要條件合適，幾乎所有蛋白質(zhì)都會發(fā)生聚集而生成聚集體。蛋白質(zhì)的聚集有不利的方面，比如造成其溶解性和活性下降，對蛋白產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生不利的影響[2-3]；蛋白聚集也有有利的一面，合適的聚集可以提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，改善產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性，甚至帶來新的特性[4]。

蛋白質(zhì)熱聚集的機(jī)理十分復(fù)雜，影響因素眾多。科學(xué)家們?yōu)榱私沂镜鞍踪|(zhì)熱聚集的原理，以不同來源的蛋白質(zhì)為原料，對其聚集的過程及所形成聚集體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析，目前已對其機(jī)理有了初步的認(rèn)識[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控各種外界條件如溫度、pH值、離子強(qiáng)度等，同一種蛋白質(zhì)亞基可形成不同類型、不同結(jié)構(gòu)和形貌以及不同性質(zhì)的聚集體[7]。

對于食品研究者來說，關(guān)注的是對食品性質(zhì)及質(zhì)量有所影響的蛋白質(zhì)聚集體。而在蛋白質(zhì)的眾多性質(zhì)中，溶解性是最為關(guān)鍵的性質(zhì)之一，它決定了蛋白質(zhì)的許多功能特性的優(yōu)劣程度。

棉籽蛋白本身溶解性不佳，在加工過程中由于發(fā)生聚集而造成溶解性進(jìn)一步下降，使其難以分散到以水為分散介質(zhì)的食品體系中，大大限制了其在食品中的應(yīng)用。因此，如何通過控制聚集而改善其溶解特性就具有重要的理論和實(shí)用意義。目前，有關(guān)蛋白熱聚集與其溶解性之間關(guān)系的研究很少，主要集中在大豆蛋白上，而相關(guān)棉籽蛋白的研究還鮮見報(bào)道。

本研究在中性pH下，以棉籽球蛋白中的主要組分7S和12S蛋白作為試驗(yàn)材料，研究熱處理對其聚集行為的影響，并對其聚集體的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)進(jìn)行了表征，結(jié)合其對蛋白質(zhì)溶解性質(zhì)的影響，探討了棉籽蛋白聚集體與其溶解之間的關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)對棉籽蛋白聚集行為的有效控制及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

棉籽球蛋白及7S和12S蛋白組分：實(shí)驗(yàn)室自制。

ANS熒光染料：Sigma公司、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、巰基乙醇(2-ME)、過硫酸銨(AP)、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺(Acr)、N，N一亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R250等：分析純；低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：電泳純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HWS-24恒溫水浴鍋：上海一恒科技；PYCZ-30垂直板電泳儀：北京六一儀器廠；電泳凝膠成像掃描儀：美國 UVP 公司；320-S梅特勒酸度計(jì)：上海闊思電子有限公司；RT10磁力攪拌器：德國IKA公司；Nano-ZS Zeta 電位及納米粒度分析儀：英國Malvern公司；UV2300紫外可見分光光度計(jì)：上海天美公司；Dimension Icon原子力顯微鏡：美國Bruker公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 棉籽分離蛋白及7S、12S熱聚集體的制備

將實(shí)驗(yàn)室自制的棉籽分離蛋白及7S、12S球蛋白以10%(m/V)的質(zhì)量濃度分散于pH為7.2、5 mmol/L的磷酸緩沖液中，磁力攪拌2 h，使棉籽蛋白充分溶解。10 000 g/min離心10 min，以除去少量未溶解部分及氣泡。采用 Lowry 等[8]報(bào)道方法對分散液中的蛋白含量進(jìn)行測定。制好的分散液貯存于-18 ℃冰箱中。

試驗(yàn)前，用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液將制好的分散液稀釋成所需濃度。吸取一定量加入玻璃試管中，用軟膠塞密封瓶口后進(jìn)行加熱處理。根據(jù)溫度的不同，加熱設(shè)備分別選用恒溫水浴鍋(<100 ℃)或高壓滅菌鍋(>100 ℃)。熱處理后劇烈振蕩并迅速在冰浴中冷卻。

1.3.2 聚丙烯酰氨凝膠電泳分析

根據(jù)Laemmli[9]報(bào)道的方法，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為3%。樣品制備：蛋白樣品溶于SDS-PAGE樣品緩沖液(0.150 mol/L Tris-HCl緩沖液，含1%(m/V)SDS、4%(V/V)巰基乙醇、5%(V/V)甘油和0.025%(m/V)溴酚藍(lán))，電泳前煮沸5 min。離心后(10 000 g/min，10 min)上樣，上樣量為15 μL，凝膠電泳在恒壓模式下進(jìn)行，在濃縮膠中電流 40 mA，進(jìn)入分離膠后增至80 mA。凝膠染色液采用 0.1%考馬斯亮藍(lán)(R-250)溶液，脫色采用含甲醇的醋酸溶液，甲醇/冰乙酸/去離子水按1∶1∶8(V/V/V)。

1.3.3 熱處理前后溶解度分析

采用 Lowry 法[8]測定溶液中蛋白濃度。配制一定濃度蛋白分散液，在不同溫度下熱處理30 min后，10 000 g/min離心15 min置于紫外-可見光分光光度計(jì)中，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品測量樣品吸光值。溶解度按公式計(jì)算。

1.3.4 蛋白質(zhì)粒度分析

稀釋后的樣品溶液經(jīng)熱處理后，用0.45 μm濾膜過濾。分別吸取1 mL 濾液置于樣品池中，采用Malvern激光納米粒度儀對加熱前后的蛋白顆粒的粒徑(Rh)進(jìn)行測定。測定溫度25 ℃，平衡時(shí)間1 min，每個(gè)樣品重復(fù)測量3次，取3次測量的平均值。

1.3.5 蛋白質(zhì)表面疏水性(S0)分析

采用ANS熒光探針法[10]檢測蛋白表面疏水性。精確稱取一定量的蛋白樣品，分別加入約為4 mL的PBS緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)中，配制成濃度梯度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的蛋白溶液。調(diào)試好熒光分光光度儀，設(shè)定激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390和470 nm，狹縫寬度為5 nm。樣品中加入適量已配制好的ANS溶液，振蕩，置于熒光分光光度計(jì)中測定樣品的相對熒光強(qiáng)度。以相對熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)濃度作圖，斜率即為S0。

1.3.6 游離巰基(SHF)分析

取2 mL一定濃度的樣品溶液，加入 10 mL pH8.0 Tris-Gly Urea溶液中，混勻后取 2 mL，加入 80 μL Ellman’s 試劑(4 mg/mL DTNB溶液)，立即混勻，室溫下放置15 min，在 412 nm波長下測定吸光值(A412)。

1.3.7 原子力顯微鏡[11]

取 2 μL加熱前后的樣品溶液(10 μg/mL)置于云母片上，用氮吹儀小心的吹干。將有樣品的云母片小心的黏貼于載玻片上，放置于Bruker Dimension Icon原子力顯微鏡載物臺進(jìn)行觀察。測試采用輕敲模式。使用Digital Nanoscope軟件 (version 1.40r3，Digital Instruments，Veeco) 分析原子力顯微鏡(AFM)圖片。

2 結(jié)果與討論

2.1 棉籽球蛋白溶解度分析

棉籽分離蛋白、7S及12S球蛋白隨pH變化的溶解性曲線如圖1所示?？偟恼f來，棉籽蛋白在絕大多數(shù)食品的pH范圍(pH 3～7)內(nèi)，其溶解度是較低的，約為30%左右。棉籽分離蛋白在pH 5時(shí)的溶解度達(dá)到最低，而7S及12S球蛋白在pH 4左右有最低溶解度。在此pH下，由于環(huán)境中存在著較多的正電荷，對蛋白分子的強(qiáng)烈排斥作用促使其分子之間的碰觸機(jī)會增大，蛋白分子易形成較大的顆粒而引起沉淀。

由圖1可知，不論是棉籽分離蛋白，還是7S及12S球蛋白，其溶解度都是在低酸性條件下較高。在pH2，棉籽蛋白幾乎可以全部溶解。是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在低于等電點(diǎn)的pH環(huán)境中，帶有凈的正電荷，分子間強(qiáng)烈的靜電排斥作用促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子與水的水合作用，因而促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解；在堿性條件下，蛋白分子的溶解度較之弱酸性及中性環(huán)境有所增大，但較之強(qiáng)酸性環(huán)境有所不如，這可能是其所帶的負(fù)電荷所造成的分子間排斥力與疏水相互作用相互競爭的結(jié)果，如果繼續(xù)增大pH值，可能其溶解度仍會有所上升，這與大豆蛋白的研究結(jié)果是一致的。

圖1 pH值對蛋白溶解性的影響

2.2 棉籽7S和12S球蛋白熱聚集體的形成及表征

2.2.1 熱聚集過程中蛋白質(zhì)分子粒徑的變化

平均粒徑(Rh)能較為直觀的反映聚集體的形成，且能間接的說明不同聚集形式的發(fā)生。圖2分別反映了天然和不同溫度熱處理后7S和12S球蛋白的平均粒徑，未處理的棉籽7S蛋白平均粒徑為40 nm左右，12S約為70 nm左右。熱處理后，7S及12S蛋白的平均粒徑都大于100 nm，特別是110 ℃熱處理蛋白，樣品的粒徑增幅更明顯，說明了蛋白質(zhì)熱聚集的發(fā)生。另外，12S平均粒徑隨加熱溫度提高的增幅大于7S，說明12S聚集速度更快，形成的聚集體顆粒體積也更加巨大。根據(jù)前期的研究結(jié)果推測，可能是因?yàn)?2S具有更為松散的結(jié)構(gòu)所致。在形成聚集體的過程中，松散的結(jié)構(gòu)不能完全將暴露于表面的疏水基團(tuán)及游離巰基包埋，因此很容易迅速而不斷的聚集下去，形成體積較大的聚集體。

圖2 熱處理7S及12S蛋白平均粒徑分布圖

2.2.2 蛋白加熱前后SDS-PAGE

前期的研究表明，天然棉籽分離蛋白中7S與12S的質(zhì)量比約為2∶1。圖3 是天然棉籽分離蛋白中7S及12S球蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果[12]。

圖4是棉籽分離蛋白的還原和非還原電泳圖。未經(jīng)加熱的CPI出現(xiàn)了7S和12S球蛋白特征條帶。在非還原狀態(tài)，熱處理7S 和 12S球蛋白的特征條帶隨加熱溫度的升高而逐漸變淺，說明進(jìn)入凝膠的蛋白質(zhì)分子減少。因?yàn)?2%的分離膠只能使小于蛋白分子單體的物質(zhì)進(jìn)入，而超越此大分子質(zhì)量的物質(zhì)則難以完全進(jìn)入凝膠[13]，據(jù)此推測蛋白可能生成了大分子質(zhì)量的聚集體而無法進(jìn)入 SDS-PAGE的分離膠中。

在還原狀態(tài)下，不論是蛋白原本的組分，還是后來形成的聚集體，都被β-巰基乙醇還原成亞基，且加熱后的蛋白經(jīng)還原后有新的條帶出現(xiàn)，說明熱處理后的蛋白有新的二硫鍵的形成，這與游離巰基下降的結(jié)果一致(表1和表2)。90 ℃度及以上的熱處理誘導(dǎo)所形成的聚集體雖然也被β-巰基乙醇還原，但在濃縮膠頂部仍出現(xiàn)了無法進(jìn)入分離膠的大分子條帶，且隨著加熱溫度的提高，該條帶逐漸清晰，這也說明除了二硫鍵外，疏水相互作用可能是形成聚集體的主要作用力。

圖3 制備所得7S和12S的SDS-PAGE分析

注：M為標(biāo)樣，L0為未加熱，L1為80 ℃，L2為90 ℃，L3為100 ℃，L4為110 ℃。圖4 熱處理前后CPI 的非還原和還原SDS-PAGE電泳圖

2.2.3 熱聚集過程中蛋白表面疏水性及巰基的變化

蛋白質(zhì)的表面疏水性不但能間接的反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且能確定蛋白的溶解度、穩(wěn)定性及自締合的能力[14]。表1和表2分別為天然和熱處理的棉籽7S及12S球蛋白表面疏水性參數(shù)(Fmax和Kd)，其中Fmax是蛋白的飽和ANS熒光強(qiáng)度，Kd是表觀解離常數(shù)。從表1和表2中可以看出，經(jīng)80～90 ℃加熱后的棉籽7S蛋白的表面疏水性略有升高，但不是很明顯，而12S球蛋白則基本沒有變化。這說明未變性的蛋白疏水性較低。然而7S 球蛋白經(jīng)100 ℃加熱，12S球蛋白經(jīng)110 ℃加熱后，F(xiàn)max和Kd顯著增加(P<0.05)，說明表面疏水性迅速升高，這是因?yàn)榧訜嶙冃允沟鞍捉Y(jié)構(gòu)充分展開，包埋于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來中，引起了疏水性的變化。這種變化很可能是蛋白質(zhì)聚集過程中的主要作用力之一。繼續(xù)升高溫度，7S和12S球蛋白的表明疏水性都有所降低，可能是因?yàn)榫奂w的形成使疏水基團(tuán)重新被包埋起來所引起的。

蛋白質(zhì)在加熱和冷卻過程中，伴隨著二硫鍵的斷裂、重排及重新生成[15]。從表1和表2中可以看出：棉籽7S和12S球蛋白經(jīng)80～120 ℃的處理后，游離-SH和二硫鍵含量的變化趨勢是一致的。未經(jīng)加熱的7S和12S球蛋白的二硫鍵含量分別約為37.51和43.13 μmol/g，隨著溫度的升高，游離巰基含量下降，二硫鍵含量緩慢增加。90 ℃時(shí)，7S球蛋白的游離巰基含量達(dá)到最低，約為3.596 μmol/g，二硫鍵含量則達(dá)到最大值，約為39.72 μmol/g；12S球蛋白加熱到100 ℃時(shí)，游離巰基含量達(dá)到最低，二硫鍵含量達(dá)到最大值。這都說明游離巰基在加熱過程中氧化成為二硫鍵，或發(fā)生了-SH-SS 互換反應(yīng)[16]。隨溫度的進(jìn)一步升高，游離-SH 含量有所回升，二硫鍵含量則在降低后趨于穩(wěn)定。通過與表面疏水性數(shù)據(jù)結(jié)合的綜合分析，可知在高溫的作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生了強(qiáng)烈的疏水聚集，致使加熱過程中所形成的游離巰基被包裹于蛋白聚集體內(nèi)部，不再發(fā)生巰基氧化或巰基與二硫鍵的轉(zhuǎn)換作用。

表1 棉籽7S球蛋白熱處理后表面疏水性及巰基的變化

注：不同字母表示同一列中不同的水平，顯著性P<0.05，余同。

表2 棉籽12S球蛋白熱處理后表面疏水性及巰基的變化

2.2.4 熱聚集體形貌分析

通過原子力顯微鏡(AFM)可以直觀的觀測蛋白分子聚集體的形貌特征。圖5是熱處理前后7S和12S球蛋白的AFM形貌圖。由圖5可知，2種球蛋白在不同溫度下的熱處理后均形成了粒徑較大的聚集體，但7S蛋白仍然保持了球狀的形態(tài)，與SAXS數(shù)據(jù)相一致；而12S球蛋白在110 ℃熱處理后形成了更大尺度的聚集體，而形態(tài)和粒徑則較不均一，說明12S蛋白生成了無定形聚集體。

圖5 熱處理7S及12S球蛋白原子力形貌高度圖

2.3 熱聚集體對其溶解特性的影響

研究表明，蛋白質(zhì)在加熱過程中可生成可溶性聚集體或不溶性聚集體，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的溶解度[11]。熱處理溫度(60～120 ℃)對棉籽7S和12S球蛋白溶解性的影響見圖6。從圖6中可以看出，CPI和12S球蛋白的溶解度隨著加熱溫度的升高呈現(xiàn)出先略微增高而后下降的趨勢，尤其是12S球蛋白，當(dāng)加熱溫度高于其熱變性溫度(103.7 ℃)后，溶解度急劇下降，結(jié)合粒徑及排阻色譜的分析結(jié)果，可將12S生成的無定形熱聚集體歸類為不溶性聚集體。7S蛋白隨著加熱溫度的升高，依然保持了較高的溶解度，雖然高于其熱變性溫度的加熱使其溶解度也發(fā)生了降低，但不像CPI和12S球蛋白那樣劇烈，可將其生成的球狀聚集體歸類為可溶性聚集體。

注：蛋白濃度為1% (mg/mL)。圖6 熱處理對棉籽分離蛋白及7S、12S球蛋白溶解度的影響

3 結(jié)論

3.1 棉籽球蛋白在中性條件下經(jīng)熱處理誘導(dǎo)生成了聚集體，通過原子力顯微鏡觀察分析，棉籽7S蛋白在中性條件下形成的熱聚集體仍然呈現(xiàn)類似球狀的形態(tài)，而12S球蛋白熱處理后形成了更大尺度的聚集體，但形態(tài)和粒徑則較不均一。

3.2 不論是棉籽分離蛋白，還是棉籽7S及12S球蛋白，在大于其熱變性溫度的熱處理下均發(fā)生溶解度減小的現(xiàn)象。但相對來說，7S蛋白依然保持了較高的溶解度，可認(rèn)為其生成的為可溶性聚集體，而12S球蛋白在熱變性后生成的聚集體則表現(xiàn)為溶解度急劇下降，可認(rèn)為生成的是不可溶性聚集體。

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Formation and Solutions of Thermal Aggregation at pH 7.0 from Cottonseed 7S and 12S Protein

Zhou Jianzhong1Gao Lei1Tao Yongxia1Zhang Hui2

(School of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University1, Wulumuqi 830052)(School of Food Science and Technology, Jiangnan University2, Wuxi 214122)

This research was to solve the problems that cottonseed protein was difficult to be developed and utilized in the food industry due to its poor solubility. The important compositions 7S and 12S protein from cottonseed were taken as the raw materials. In addition, the aggregation of 7S and 12S protein was induced by heating at neutral conditions; the structure and characteristics of the aggregates formed during heating and its solubility properties were analyzed. And, finally the relation between protein solubility and protein aggregation was discussed. It was found that the 12S protein the aggregates generated after the thermal denaturation showed a sharp decline in the solubility, which can be considered to form the insoluble aggregates. As for 7S globulin, it still, relatively speaking, maintained a higher solubility, which could be considered as soluble aggregates. These results would be useful to better understand the cottonseed proteins, to further improve the quality of cottonseed protein products and provide theoretical base for its development and utilization.

cottonseed globulin protein, thermal aggregation, structural properties, solutions

TQ645

A

1003-0174(2017)10-0060-06

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2014211B016)

2016-09-23

周建中，男，1979年出生，副教授，糧食、油脂與植物蛋白工程

張暉，女，1966年出生，教授，糧食、油脂與植物蛋白工程