李海波 丁紅梅 陳友吾 徐 梁 李 楠 胡傳久

(浙江省林業(yè)科學研究院;浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室1，杭州 310023)(浙江中醫(yī)藥大學2，杭州 310053)

12個油茶品種的SSR特征指紋鑒別

李海波1丁紅梅2陳友吾1徐 梁1李 楠1胡傳久1

(浙江省林業(yè)科學研究院;浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室1，杭州 310023)(浙江中醫(yī)藥大學2，杭州 310053)

為了對普通油茶(Camelliaoleifera)優(yōu)良品種的準確鑒別開發(fā)一種新的分子識別方法，為油茶優(yōu)良品種資源的保護提供技術支持，本研究擬利用SSR熒光標記構建12個長林系列油茶品種的SSR特征指紋。14對多態(tài)性SSR引物從12個油茶品種的14個SSR位點共擴增出62個多態(tài)性條帶、檢測出77種基因型，平均每個SSR引物擴增出4.4個多態(tài)性條帶、檢測出5.5種基因型。12個油茶品種14個SSR位點的多態(tài)信息含量變化范圍和Dice遺傳相似系數(shù)變異范圍分別為0.08～0.84和0.39～0.90?；?2個油茶品種在14個SSR位點的基因型差異，共選出45種SSR特征引物與其對應的基因型組合，即SSR特征引物-基因型，可作為11個油茶品種的SSR特征指紋，為品種鑒別提供分子依據(jù)。本研究也為在更大層面上建立油茶品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫、為油茶品種的輔助選育、以及應用于DUS測試提供了技術思路。

油茶 基因型 品種鑒別 SSR指紋 熒光檢測

普通油茶(Camelliaoleifera)在我國的栽培歷史悠久，具有分布區(qū)域廣、栽培面積大、用途多等特點，并集經濟價值于一身[1]。油茶是我國南方重要的木本油料樹種，在生態(tài)經濟建設中占有重要地位。早在上個世紀60年代以來，我國林業(yè)育種工作者就開展了油茶品種的選育工作，并取得了重大突破。先后選育出了一批優(yōu)良的單株、無性系和家系等[2]，其中，具有早實、 豐產和穩(wěn)產特點的油茶優(yōu)良無性系已作為我國油茶生產上最重要的品種資源而廣為推廣應用[3]。畝產油量達到50 kg以上的新品系，成為油茶發(fā)展的主栽品種[4]。近年來，在國家政策的大力扶持下，油茶產業(yè)迅速發(fā)展，油茶品種苗木市場在出現(xiàn)供不應求的同時，也出現(xiàn)了品系混雜、 以假亂真、以次充好的現(xiàn)象。油茶無性系品種的真實性問題一度成為困擾油茶產業(yè)化發(fā)展的主要問題之一。

對普通油茶各無性系的識別主要依賴于對其表觀特征的選擇，但是由于許多形態(tài)性狀的鑒定周期長，受環(huán)境影響大，而且隨著無性系數(shù)量的不斷增多，鑒別也愈加困難。況且，用于大面積推廣的油茶芽砧苗尚不具備可用于識別的形態(tài)、 生物學特征以及經濟性狀[2]。21世紀以來，分子標記技術包括隨機擴增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)[5]、簡單重復序列間區(qū)(inter simple sequence repeat, ISSR)[6]、相關序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)[7]開始陸續(xù)應用于油茶的生產技術研究，為油茶優(yōu)良無性系的品種鑒別與優(yōu)良品系的分子選育提供一種新的技術手段[2，4,8-11]。簡單重復序列(Simple sequence repeats，SSR)主要是以2～5個核苷酸為基本重復單位的串聯(lián)重復序列[12]。SSR為共顯性標記，能區(qū)分純合子和雜合子，能檢測復等位基因，且具有多態(tài)性豐富、操作簡單、結果可靠、重復性好等優(yōu)點。通過構建 SSR 指紋圖譜可以快速、準確進行品種鑒定，已在水稻、小麥、玉米等一些重要作物上得以應用[13-15]。因此，探索基于SSR標記構建油茶品種的特征DNA指紋，不僅可用于油茶品種的真?zhèn)舞b定，為品種的知識產權保護提供科學依據(jù)，也可為油茶新品種的分子輔助選育奠定基礎。截至目前，SSR標記在油茶上的應用包括SSR-PCR體系的優(yōu)化研究[16]和種質資源的遺傳多樣性分析[17-19]。此外，也有山茶屬(Camellia)內紅花油茶(C.chekiangoleosa)的SSR標記開發(fā)[20]、小果油茶(C.meiocarpa)與普通油茶的種間雜交漸滲的報道[21]，但鮮有基于SSR標記的油茶品種DNA指紋圖譜構建及品種鑒別的研究報道。

通過國家林木品種審定的長林系列油茶品種是經過優(yōu)樹選擇、采穗圃觀察和當代鑒定的系統(tǒng)程序選育出來的，具有早實豐產、穩(wěn)產、出籽率高、含油量高、抗性強、適應性廣等特性的優(yōu)良無性系。本研究選用長林系列油茶的12個品種作為材料，首次通過Illumina轉錄組測序(transcriptome sequencing)平臺挖掘出有價值的SSR標記，建立油茶品種的SSR特征指紋，為油茶優(yōu)良無性系的準確鑒別開發(fā)一種新的分子識別方法，為油茶優(yōu)良品種資源的保護提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料

用于本研究的12個長林系列油茶(C.oleifera)品種無性系來自浙江省林業(yè)科學研究院在浙江省武義縣俞源鎮(zhèn)鐘蓬村建立的百靈谷油茶幼林基地，分別為：長林3號(CL3)、4號(CL4)、18號(CL18)、21號(CL21)、23號(CL23)、26號(CL26)、27號(CL27)、40號(CL40)、53號(CL53)、55號(CL55)、56號(CL56)、166號(CL166)。12個油茶優(yōu)良無性系的主要經濟性狀參見林萍等[4]的報道。在本試驗中，對每個油茶品種均采集3株，取每株3～5個幼嫩葉片，放置于裝有硅膠的密封袋干燥保存，至完全失水后作為提取基因組DNA的供試材料。

1.2 主要試劑

新型快速植物基因組DNA提取試劑：北京BioTeke公司；PCR擴增試劑2TSINGKE Master Mix：北京Tsingke公司。在SSR正向引物上加注的熒光染料是FAM(藍)，SSR引物由北京Tsingke公司合成。毛細管電泳檢測的內標試劑：Hi-DiTMFormamide、GeneScanTM-500 LIZ Size Standard，美國Applied Biosystems公司。

1.3 主要儀器與設備

PCR儀：杭州博日科技有限公司；凝膠電泳儀：美國伯樂公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司；NanoDrop 2000分光光度計，美國熱電公司；DNA分析儀：3730 xl，美國Applied Biosystems公司。

1.4 方法

1.4.1 油茶基因組DNA的提取及濃度測定

將每個油茶品種3株經硅膠干燥后的幼嫩葉片粉碎，取等量混合后作為基因組DNA的提取樣品。DNA提取方法參照新型快速植物基因組DNA提取試劑的操作說明，提取后的DNA經分光光度計測定濃度，并經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 油茶SSR標記來源

根據(jù)課題組前期對長林油茶的Illumina轉錄組測序獲得的序列數(shù)據(jù)，共篩選出了9個具有穩(wěn)定多態(tài)性的EST-SSR標記引物；除此之外，根據(jù)彭嬋等[17]、Jia等[18]、Wen等[20]和黃勇[21]報道的54對茶屬SSR引物，共篩選出了5個具有穩(wěn)定多態(tài)性的SSR標記引物(表1)。

1.4.3 SSR-PCR分析

1.4.4 毛細管電泳檢測

內標配制：取10 mL Hi-Di和80 μL GeneS-canTM-500 LIZ Size Standard混勻，離心，以每孔10L分裝于96孔內標板，離心。將SSR-PCR產物電泳，根據(jù)電泳膠圖做一定稀釋(最低可檢測標準為0.1 ng/L)，離心。取稀釋產物0.5L加入到分配好的內標板中，混勻，離心，放入PCR儀，于96 ℃變性5 min。20℃下迅速冷凍2 min，離心。置入DNA分析儀進行毛細管電泳檢測。用Data Collection 3.0軟件收集數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用GeneMapper 4.1軟件對Data Collection 3.0軟件收集的原始數(shù)據(jù)進行分析。軟件系統(tǒng)將根據(jù)目標峰的位置與同一泳道中的內標GeneScanTM-500 LIZ Size Standard進行比較，直接給出目標SSR片段的準確數(shù)值(bp)。純合位點的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/X， 其中X為該等位變異的數(shù)值大?。浑s合位點的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點2個不同等位變異的數(shù)值大小。

SSR多態(tài)性分析評價采用以下參數(shù)：總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)率，以及多態(tài)性信息含量(Polymorphic information content，PIC)。PIC的計算公式[22]為：PICi=1-∑Pij2，式中：PICi指分子標記i的多態(tài)性信息量，Pij指i標記中第j個類型所發(fā)生的頻率。

表1 用于本研究的油茶多態(tài)性SSR引物

遺傳關系分析：對于每個檢測位點，具有相同數(shù)值的SSR標記記為1，無該數(shù)值的SSR標記記為0，構成0/1原始數(shù)據(jù)矩陣。利用 NTSYS-pc2.10e軟件進行遺傳多樣性分析，使用軟件中的SimQual程序計算樣品間的Dice遺傳相似系數(shù)，用SAHN程序進行UPGMA(非加權成對算術平均法)聚類分析，通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 油茶SSR標記多態(tài)性分析

14對SSR引物在12個油茶品種中共擴增出67個條帶，擴增片段大小為96～273 bp，每對引物擴增出的條帶數(shù)為2～9個，平均為4.8個。67個條帶中的62個為多態(tài)性條帶，平均每對引物擴增出4.4個多態(tài)性條帶。綜合多態(tài)率為92.5%，每個引物的平均多態(tài)率為91.7%。多態(tài)信息量(Polymorphic information content，PIC)為0.08～0.84，平均為0.53(表2)。

表2 供試油茶品種的SSR標記擴增結果

2.2 基于SSR標記的的遺傳關系分析

基于14對SSR引物擴增出的67個條帶對12個油茶品種的聚類結果顯示(圖1)，12個油茶品種沒有形成明顯的具有規(guī)律性的成組分類，表明12個油茶品種間的遺傳背景復雜，遺傳差異較大。從聚類圖上可以看出，12個油茶品種在Dice遺傳相似系數(shù)大約為0.43時聚在一起，在大約0.59時可分聚為7個組，分別為長林3號與56號，21號與166號，4號、27號與40號，23號與55號，以及三個單組包括長林53號、18號和26號。從Dice遺傳相似系數(shù)來看，12個油茶品種的Dice遺傳相似系數(shù)變異范圍在0.39(長林3號與26號)至0.90(長林27號與40號)之間，這與聚類圖顯示的長林27號與40號在0.90時聚為一組、長林3號與26號各自位于聚類圖的頂部與底部具一致性，表明長林27號與40號的遺傳差異最小，親緣關系最為接近；而長林3號與26號的遺傳差異最大，親緣關系最遠。

圖1 基于SSR標記構建的12個油茶品種聚類樹狀圖

2.3 油茶SSR位點的基因型差異分析

表3顯示，14個SSR引物對在12個供試油茶品種的14個SSR位點共檢測出了77種不同的基因型，每對引物檢測出2～10種基因型，最低的為引物Co3、Co51、Co66和Co84，最高的為引物CoUg10161，平均為5.5種。在77種基因型中，純合型為33種，雜合型為44種。此外，12個油茶品種在不同SSR位點表現(xiàn)出的基因型數(shù)量存在較大差異。例如，在Co3位點，12個油茶品種僅有2種基因型；在Co41位點，有5種基因型；而在CoUg10161引物位點，有10種基因型。

SSR位點上豐富的基因型差異為油茶品種鑒別提供了可能，特別是某個油茶品種在一些SSR引物位點所特有的基因型。表3顯示，除長林40號油茶外，其他11個油茶品種在14個SSR位點上均表現(xiàn)出特有基因型。例如，在Co3位點，長林26號表現(xiàn)出特有基因型138/141；在Co53位點，長林18號和166號分別表現(xiàn)出特有基因型267/273和267/270；在CoUg10161位點，長林3號、18號、21號、23號、26號、53號、55號、56號和166號分別表現(xiàn)出特有基因型196/196、186/186、186/196、188/188、190/190、190/192、188/190、190/200和196/208。不同油茶品種在14個SSR位點的基因型差異，尤其是特有基因型的發(fā)現(xiàn)為油茶品種SSR指紋圖譜的建立提供了有價值的數(shù)據(jù)。

2.4 油茶品種的SSR特征指紋與品種鑒定

基于12個油茶品種在SSR位點的基因型差異，進一步比較、選出每個油茶品種的特征引物與其對應的基因型，即特征引物-基因型，如CoUg10161-196/196、TUGMS17-218/242、CK55-182/200等，可作為各個油茶品種的SSR特征指紋，為品種鑒別提供分子依據(jù)(表4)。表4顯示，除長林40號油茶品種缺乏特征引物-基因型外，其他11個品種共有45種不同的特征引物-基因型，即45種SSR特征指紋。而且，這11個油茶品種具有不同的SSR特征指紋數(shù)，依次為：長林23號=53號=56號(6種指紋)>長林21號=26號=166號(5種)>長林18號=55號(4種)>長林3號(2種)>長林4號=27號(1種)。從特征引物在12個油茶品種間檢測出的特異基因型的數(shù)量來看，依次為：CoUg10161(9種)>TUGMS17(7種)>CK55(6種)>Co81= Co74(5種)>CK03(4種)>TUGMS28(3種)>Co41= Co53(2種)>Co62=C53(1種)。這表明不同SSR引物對油茶品種鑒別的貢獻大小不同。因此，基于本研究開發(fā)的SSR特征指紋，在實際應用中可以優(yōu)先選用多態(tài)性高、貢獻大的特征引物，以提高鑒別效率。同時，每個油茶品種的多個SSR特征指紋均可以用于鑒別，以提高鑒別的可靠性。

表3 12個供試油茶品種的基因型

表4 12個供試油茶品種的SSR特征指紋(特征引物-基因型)

對于長林40號品種，由于缺乏特征引物-基因型，可以采用二對引物或二對以上的SSR引物的聯(lián)合使用來鑒別。根據(jù)表3顯示的基因型差異，可以聯(lián)合使用引物Co62和CK03，根據(jù)二對引物在長林40號品種檢測的基因型Co62-209/212和CK03-135/141來鑒別長林40號品種；也可以聯(lián)合使用引物CK55和TUGMS28，根據(jù)它們檢測的基因型CK55-198/200和TUGMS28-164/186來鑒別長林40號品種。

3 討論

目前，我國林業(yè)工作者選育出的普通油茶良種都是從實生群體中選育而來，群體中遺傳基因交流頻繁，具有高度雜合性，而且生殖周期較長，沒有自交、 雜交的純系[23]，這也使得油茶的遺傳背景相對復雜，遺傳多樣性豐富。此外，普通油茶的倍性較為復雜，一個SSR位點可能檢測到多個等位基因[21]。本研究結果不僅進一步支持了我國油茶品種具有高度雜合的遺傳背景，也提示這14個多態(tài)性SSR標記可以用于更多的普通油茶品種，以揭示種內更為豐富的基因型差異而用于品種鑒別，也可用于普通油茶遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建以及山茶屬(Camellia)內物種間的遺傳關系研究。

SSR熒光標記是基于DNA測序儀為平臺的檢測方法，克服了傳統(tǒng)銀染法聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的不足，具有快速、高效、精確、靈敏等技術優(yōu)勢。該技術在小麥[24]、玉米[25]、煙草[26]、水稻[27]、高粱[28]等物種上的應用得出在同一檢測成本上，熒光標記技術檢測效率遠高于銀染法，更適用于高通量材料的指紋圖譜構建和品種鑒定研究。本研究采用SSR熒光標記毛細管電泳檢測方法，直接以堿基數(shù)目(bp)確定了12個油茶品種在14個SSR位點的基因型，基于基因型差異建立了可用于11個品種鑒別的特征SSR指紋，數(shù)據(jù)更為精確可靠，證明了SSR熒光標記用于油茶品種指紋圖譜構建和品種鑒定的可行性。

獲得多態(tài)性高的SSR引物是SSR指紋鑒別的必要保證。多態(tài)性信息含量(PIC)值的高低和等位變異的數(shù)量是衡量SSR引物多態(tài)性的基本指標。與彭嬋等[17]、Jia等[18]和張恩慧等[19]的研究相比，本研究所采用的14個多態(tài)性SSR引物的PIC值和基因型數(shù)量的變化幅度均較大，且PIC值偏低(0.08～0.84，平均0.53)，基因型數(shù)量較高(2～10種，平均5.5種)。這是由于所采用SSR引物的多態(tài)性高低存在較大差異，因而對油茶品種SSR指紋鑒別的貢獻大小不一。因此，在SSR指紋鑒別中，不僅需要開發(fā)出更多、多態(tài)性更高的SSR引物，獲得單個品種(例如本研究的11個品種)特征引物-基因型，同時也要采用不同的引物組合才能完成多個品種的相互鑒別，正如本研究利用Co62和CK03組合、和CK55和TUGMS28組合來鑒別長林40號品種。

DUS(特異性Distinctness、一致性Uniformity、穩(wěn)定性Stability)測試是植物新品種保護的技術基礎和授權的科學依據(jù)。國際植物新品種保護聯(lián)盟(UPOV)已將SSR標記作為DNA指紋數(shù)據(jù)庫構建的推薦標記之一。國內外已有不少將SSR標記用于玉米[29-30]、小麥[31]、水稻[32]、油菜[33]、多花黑麥草[34]、棉花[35]、茶樹[36]等DNA指紋數(shù)據(jù)庫構建的報道，但迄今將SSR分子標記應用于油茶DUS測試的研究還未見報道。因此在本研究基礎上，今后工作的重點是將SSR分子標記技術拓展到油茶品種分子標記DUS測試指南的研制和油茶品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構建，為油茶新品種申請、測試與鑒定提供補充依據(jù)。

開發(fā)出一套油茶品種的高效分子鑒別技術，無論在科研服務層面上對于油茶品種鑒別、保護油茶品種知識產權，還是在產業(yè)層面上對于油茶產業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，均提供了一種有價值的技術支撐。本研究表明利用SSR熒光標記技術可以獲得油茶品種在SSR位點的特征指紋，可彌補在油茶芽砧苗期不具備可識別特性的不足，從而用于對油茶品種的輔助鑒別，從根本上保證油茶種苗的質量。

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Identification of 12 Superior Cultivars ofCamelliaoleiferaby Using Simple Sequence Repeat Feature Indexes

Li Haibo1Ding Hongmei2Chen Youwu1Xu Liang1Li Nan1Hu Chuanjiu1

(Zhejiang Academy of Forestry Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biological and Chemical Utilization of Forest Resource1, Hangzhou 310023) (Zhejiang Chinese Medical University2, Hangzhou 310053)

In order to develop a novel molecular recognition method for the identification of oil tea (Camelliaoleifera) superior cultivars and provide technical support for the protection of superior resources, the SSR feature indexes for 12 Changlin series superior cultivars ofC.oleiferawere constructed by using SSR fluorescence labeling in the present study. With 14 pairs of polymorphic SSR primers, a total of 62 polymorphic bands were amplified and 77 genotypes were detected from the 14 SSR loci in the studied 12 superior cultivars ofC.oleifera. For each SSR primer, the average number of polymorphic bands and genotypes were 4.4 and 5.5, respectively. The range of polymorphism information content (PIC) and genetic similarity byDicecoefficients at 14 SSR loci in the 12 cultivars were 0.08～0.84 and 0.39～0.90, respectively. Based on the genotypic difference at the 14 SSR loci, a total of 45 pairs of SSR characteristic primers together with its corresponding genotype (SSR characteristic primer pairs-genotype) were selected as SSR characteristic fingerprints for the molecular recognition of 11 Changlin series superior cultivars ofC.oleifera. This study also provided the technical ideas for establishing DNA fingerprint database ofC.oleiferaon a higher level, for the molecular breeding of superior cultivars ofC.oleifera, and for DUS (distinctness, uniformity and stability) testing ofC.oleifera.

Camelliaoleifera, genotype, cultivar identification, SSR fingerprints, fluorescence detection

S722.3

A

1003-0174(2017)10-0171-08

時間：2017-10-20 13:24:01

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2864.TS.20171020.1324.002.html

浙江省科研院所扶持專項(2014F30002,2013F5 0012),浙江省重大科技專項(2010C02005-1)

2017-03-18

李海波，男，1969年出生，研究員，林木遺傳育種

胡傳久，男，1982年出生，副研究員，經濟林栽培