程安瑋 吳劍夫 秦宏偉 楊清梅 劉 超 郭 溆 孫金月

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所；山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室1，濟南 250100)(濟寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系2，濟寧 272113)

4種豆類中多酚、類黃酮含量及抗氧化活性研究

程安瑋1吳劍夫1秦宏偉2楊清梅1劉 超1郭 溆1孫金月1

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所；山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室1，濟南 250100)(濟寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系2，濟寧 272113)

對豇豆、紅小豆、綠豆和蠶豆4種豆類中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的多酚及類黃酮的含量進行測定，并比較了其體外抗氧化活性。數(shù)據(jù)表明，4種不同豆類的游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚含量范圍分別為1.35～1.75 mg/g和8.63～10.11 mg/g；游離態(tài)類黃酮和結(jié)合態(tài)類黃酮含量范圍分別為1.58～2.07 mg/g和3.92～5.08 mg/g；其中結(jié)合態(tài)多酚含量是游離態(tài)多酚的5倍以上，結(jié)合態(tài)類黃酮含量是游離態(tài)的2倍以上。4種豆類游離態(tài)和結(jié)合態(tài)提取物均具有良好的抗氧化活性，其中游離態(tài)提取物對DPPH自由基的清除能力明顯高于結(jié)合態(tài)，而結(jié)合態(tài)對FRAP、ABTS、O2-自由基的清除能力明顯高于游離態(tài)。豆類中含有豐富的酚類、類黃酮等物質(zhì)，并且主要以結(jié)合態(tài)形式存在，具有較強的抗氧化活性。

豆類 多酚 類黃酮 抗氧化

我國傳統(tǒng)飲食講究“五谷宜為養(yǎng)，失豆則不良”[1]。酚類、類黃酮等物質(zhì)在植物生長和發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，且具有較強的抗氧化活性，從而可以保護體內(nèi)生物大分子免受氧化的損傷[2]。豆類中含有豐富的多酚、類黃酮和原花青素類等物質(zhì)，是良好的天然抗氧化物質(zhì)[3-4]。鞏藹等[5]研究發(fā)現(xiàn)常見的8種豆類中類黃酮提取物對DPPH自由基清除率在69%以上。任順成等[6]證實15種常見食用豆類提取液均表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。植物中多酚、類黃酮等成分根據(jù)結(jié)合方式和提取方法的不同，可分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)。游離態(tài)是指游離于細胞壁外的多酚及類黃酮成分，可直接用常規(guī)的甲醇、乙醇等有機溶劑分離提取出來；結(jié)合態(tài)主要指一些水合丹寧酸以及與纖維或蛋白結(jié)合的原花青素、類黃酮等，需通過化學(xué)或酶處理方法將多酚從細胞壁上提取出來[7]。由于缺乏合適的分析方法，對結(jié)合態(tài)提取物的研究沒有引起重視。目前大多文獻中對多酚/類黃酮的研究實際上是指游離態(tài)多酚/類黃酮，而對結(jié)合態(tài)多酚/類黃酮的研究較少?？偠喾?類黃酮是指游離態(tài)多酚/類黃酮和結(jié)合態(tài)多酚/類黃酮的加和。游離態(tài)多酚/類黃酮的功能性研究很多，具有抗氧化、抗炎、提高機體免疫等功效。而結(jié)合態(tài)多酚/類黃酮一直不被列為食物的營養(yǎng)組成，結(jié)合態(tài)多酚/類黃酮是食物中具有生物活性的成分，可被結(jié)腸中細菌發(fā)酵，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對人體十分有益[8]。大多文獻中對豆類活性物質(zhì)的含量及抗氧化能力的研究僅限于游離態(tài)[5-6]，而很少對游離態(tài)和結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化活性進行比較研究。本試驗以豇豆、紅小豆、綠豆、蠶豆4種常見食用豆類為材料，比較豆類中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚及類黃酮的含量及其抗氧化活性，為豆類資源的深度開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆、紅小豆、綠豆、蠶豆：市售，含水量<5%。ABTS[2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]、沒食子酸、蘆?。篠igma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；O2-試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆類原料中游離態(tài)提取物的制備

參考Esparza-Martínez等[9]方法并略作修改，將原料粉碎過100目篩，準(zhǔn)確稱取10 g豆粉，按照1∶40(m/V)加入400 mL 50%乙醇溶液超聲1 h，3 000 r/min離心20 min，分離上清液，重復(fù)1次，將2次上清液合并備用。

1.3.2 豆類原料中結(jié)合態(tài)提取物的制備

參考Arranz等[7]方法并略作修改，游離態(tài)提取物后剩余的殘渣干燥成粉，稱取2 g殘渣粉，按照1∶10(m/V)加入20 mL甲醇/硫酸(9∶1，V/V)混合溶液，85 ℃下水解20 h，4 500 r/min離心10 min，分離上清液待用。

1.3.3 多酚含量的測定

根據(jù)謝倩等[10]福林酚法進行。取2 mL蒸餾水加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，然后加100 μL樣品提取液混勻，3 min后加入900 μL 20% Na2CO3溶液，避光2 h，測其在765 nm下的吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.003 9x+0.016 6(R2=0.998 7)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的多酚含量?？偠喾雍繛橛坞x態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚的加和。

1.3.4 類黃酮含量的測定

參照Xu等[11]方法并略作修改。取1 mL提取液加入1 mL5%NaNO2溶液混勻反應(yīng)6 min，再加入1 mL10% Al(NO)3溶液混勻，反應(yīng)6 min，最后加入3 mL 4%NaOH溶液混勻，510 nm處測其吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.004 5x-0.008 2(R2=0.995 5)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中類黃酮的含量?？傤慄S酮的含量為游離態(tài)類黃酮和結(jié)合態(tài)類黃酮的加和。

1.3.5 DPPH自由基清除試驗

取1 mL提取液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，室溫下避光靜置15 min，以50%乙醇為空白，于517 nm下測定吸光度值[12]。DPPH自由基清除率計算公式為：SA=(1-A1/A0)×100%，式中：A1為2 mL DPPH +1 mL樣液吸光度；A0為2 mL DPPH+1 mL 50%乙醇溶液吸光度。

1.3.6 總抗氧化能力(ABTS)的測定

參照李華等[13]方法并略作改動。取200 μL樣品溶液與4 mL 7 mmol/L ABTS液混合，37 ℃下水浴10 min，在734 nm下測定吸光度值A(chǔ)1。用50%乙醇調(diào)零，同時測定不加樣品(空白對照)的吸光值A(chǔ)0。ABTS自由基清除率：SA=(A0-A1)/A0×100%。

1.3.7 鐵離子還原能力(FRAP)的測定

取樣品溶液1 mL，依次加入2.5 mL的0.2 mol/LPBS緩沖液(pH=6.6)和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，充分混勻于50 ℃下保溫20 min。然后與2.5 mL 10%三氯乙酸溶液混勻，4 500 r/min下離心10 min。取2.5 mL上清液依次加入2.5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵充分混勻后反應(yīng)10 min，700 nm下測定吸光度值[14]。

1.3.8 超氧陰離子(O2-)清除率試驗

按照超氧陰離子自由基試劑盒說明書操作，550 nm處測定吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 豆類中多酚及類黃酮的含量

豇豆、紅小豆、綠豆、蠶豆4種豆類中游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚以及游離態(tài)類黃酮和結(jié)合態(tài)類黃酮的含量見表1。4種豆類中總多酚含量在10.38～11.86 mg/g，其中游離態(tài)多酚含量在1.35～1.75 mg/g，結(jié)合態(tài)多酚含量在8.63～10.11 mg/g，結(jié)合態(tài)多酚含量顯著高于游離態(tài)的含量，是游離態(tài)多酚含量的5倍以上，但不同原料間游離態(tài)多酚、結(jié)合態(tài)多酚及總多酚的含量差別不大。4種豆類中，總類黃酮含量在5.83～6.66 mg/g，其中游離態(tài)類黃酮含量在1.58～2.07 mg/g，結(jié)合態(tài)類黃酮含量在3.92～5.08 mg/g，結(jié)合態(tài)類黃酮含量明顯高于游離態(tài)的含量。結(jié)果表明，豆類中多酚和類黃酮主要以結(jié)合態(tài)的形式存在。Baginsky等[15]研究證明，一種智利產(chǎn)的未成熟蠶豆中游離態(tài)多酚含量為1.10 mg/g，低于本試驗的結(jié)果。Siah等[16]以澳大利亞產(chǎn)不同種皮顏色的蠶豆為研究對象，其多酚含量在8.6～11.2 mg/g，與本研究結(jié)果相差較大，可能原因在于品種和產(chǎn)地不同。趙艷等[17]研究小扁豆、紅蕓豆、鷹嘴豆等雜豆中游離態(tài)多酚含量在1.24～15.07 mg/g范圍內(nèi)，與本研究結(jié)果基本一致。

表1 豆類中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚及類黃酮含量

注：同行肩標(biāo)有相同字母表示沒有明顯差異(P>0.05)，字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.2 豆類提取物對DPPH自由基清除率的影響

4種豆類提取物對DPPH自由基清除率明顯，游離態(tài)提取物的自由基清除能力明顯高于結(jié)合態(tài)。紅小豆中游離態(tài)多酚和游離態(tài)類黃酮含量較高，所表現(xiàn)的清除能力強。綠豆中游離態(tài)多酚和類黃酮的量都偏低，所表現(xiàn)的清除能力也較弱。雖然原料中結(jié)合態(tài)的提取物含量較高，但由于采用酸提取法進行提取，溶液的酸堿度對DPPH的清除能力有一定的影響，因此表現(xiàn)出的自由基清除能力不強，其中紅小豆結(jié)合態(tài)提取物的清除率最強，綠豆的最低，見圖1。

圖1 豆類提取物對DPPH自由基清除率的影響

2.3 豆類提取物對ABTS抗氧化能力的影響

圖2表明，4種豆類結(jié)合態(tài)提取物對ABTS抗氧化能力都達到了90%，除蠶豆組，其余各組之間差別不大(P>0.05)。游離態(tài)提取物對ABTS抗氧化能力在60%以上，明顯低于結(jié)合態(tài)，主要是由于結(jié)合態(tài)提取物的含量明顯高于游離態(tài)。紅小豆的游離態(tài)提取物對ABTS抗氧化能力最強，其次為豇豆和綠豆，蠶豆的清除能力最低。

圖2 豆類提取物對ABTS抗氧化能力的影響

2.4 豆類提取物對FRAP還原能力的影響

圖3表明，4種豆類結(jié)合態(tài)提取物的FRAP還原能力明顯強于游離態(tài)多酚，主要由于原料中結(jié)合態(tài)提取物的含量明顯高于游離態(tài)的含量。豇豆結(jié)合態(tài)提取物的還原能力最高，其余三者差別不大。游離態(tài)提取物中，紅小豆中所含多酚和類黃酮含量較高，所表現(xiàn)的FRAP還原能力較強；而綠豆、蠶豆和豇豆的FRAP還原能力偏弱，但之間差別不大。

圖3 豆類提取物對FRAP還原能力的影響

2.5 豆類提取物對超氧陰離子清除率的影響

圖4表明，4種豆類的結(jié)合態(tài)提取物對超氧陰離子自由基的清除率均明顯高于游離態(tài)提取物。綠豆中結(jié)合態(tài)提取物的清除能力最高，其余三者之間沒有明顯差異(P>0.05)。蠶豆中游離態(tài)類黃酮含量較低，因此表現(xiàn)為對自由基的清除能力較低，豇豆和綠豆中游離態(tài)多酚和類黃酮含量較高，其清除能力高，但兩者之間沒有明顯差異(P>0.05)。O2-自由基清除率與游離態(tài)類黃酮的含量呈正相關(guān)。

圖4 豆類提取物對超氧陰離子自由基清除率的影響

3 討論與結(jié)論

綠豆、紅小豆、蠶豆、豇豆4種豆類中主要以結(jié)合態(tài)的多酚和類黃酮形式存在，其中結(jié)合態(tài)多酚含量是游離態(tài)多酚的5倍以上，結(jié)合態(tài)類黃酮含量是游離態(tài)的2倍以上。Arranz等[7]研究表明，谷類、蔬菜、豆類、水果、堅果中含有大量的結(jié)合態(tài)多酚，其含量遠遠超過游離態(tài)多酚，其中蘋果、桃子及油桃中結(jié)合態(tài)多酚含量是游離態(tài)多酚的5倍以上，與本試驗結(jié)果基本一致。Adom等[18]研究表明，小麥、大米、燕麥及玉米中結(jié)合態(tài)多酚占總多酚比例分別76%、62%、75%、85%，因此總多酚主要以結(jié)合態(tài)的形式存在，與本試驗結(jié)果相一致。游離態(tài)提取物是一種易在上消化道內(nèi)被吸收利用的物質(zhì)，而結(jié)合態(tài)提取物與細胞壁連接，難以在胃腸道中被酶消化，通過結(jié)腸微生物發(fā)酵將其釋放，被吸收后主要在結(jié)腸部位發(fā)揮生理活性[19]。

豇豆、綠豆、紅小豆、蠶豆4種豆類中，多酚及類黃酮主要以結(jié)合態(tài)形式存在，結(jié)合態(tài)多酚及類黃酮的含量明顯高于游離態(tài)，但總多酚的含量差別不大。4種豆類的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)提取物具有明顯的抗氧化活性，其中游離態(tài)提取物對DPPH自由基的清除能力高于結(jié)合態(tài)，而結(jié)合態(tài)提取物對FRAP、ABTS、O2-自由基清除率明顯高于游離態(tài)。豆類中含有豐富的酚類和類黃酮物質(zhì)，并具有較強的抗氧化活性，因此可以作為天然抗氧化劑進行開發(fā)利用，進一步提高豆類資源的綜合開發(fā)利用水平。

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Content and Antioxidant Activity of Polyphenols and Flavonoids from 4 Food Beans

Cheng Anwei1Wu Jianfu1Qin Hongwei2Yang Qingmei1Liu Chao1Guo Xu1Sun Jinyue1

(Institute of Agro-food Science and Technology；Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong, Shandong Academy of Agricultural Science1,Jinan 250100) (Department of Life Science and Engineering of Jining University2, Jining 272113)

The contents and antioxidant activity of free state and speciation ofpolyphenols from cowpea, Vigna angularis, mung bean and broad bean were researched. The results showed that the free stateand speciation ofpolyphenols’contents of beans ranged from 1.35 to 1.75 mg/g, 8.63 to 10.11 mg/g, respectively. The free stateand speciation of flavonoids’ contents of the beans ranged from 1.58 to 2.07 mg/g, and 3.92 to 5.08 mg/g, respectively. The contents of speciation in polyphenols are five times more than free state in it, and the contents of speciation in flavonoids are twice more than free state in it. The free stateand speciation extracts have significant antioxidant activity, and the free state extracts on DPPH scavenging activity outclassed that of speciation in extracts. But the speciation inextracts on FRAP, ABTS and O2-scavenging activity outclassed that of free state in extracts. Beans are rich in polyphenols and possess high antioxidant activity. The speciations in polyphenols/flavonoids were the main existing forms of polyphenols/flavonoids.

beans, polyphenols, flavonoids,antioxidation

TS221

A

1003-0174(2017)10-0028-05

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科技成果培育專項(2016CG PY09)，山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC 2016B16)

2016-09-08

程安瑋，女，1975年出生，博士，生物活性物質(zhì)與功能食品

孫金月，男，1967年出生，研究員，生物活性物質(zhì)與功能食品