耿偉濤，李炳功，劉珊，郭金體，李超，王艷萍，*

（1.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津300457；2.天津?qū)毜剞r(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，天津300457）

秀珍菇液態(tài)發(fā)酵及主要活性成分分析

耿偉濤1，李炳功1，劉珊1，郭金體2，李超1，王艷萍1，*

（1.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津300457；2.天津?qū)毜剞r(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，天津300457）

為了秀珍菇的進一步開發(fā)利用，對秀珍菇進行了7L氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)，并對其發(fā)酵液和菌絲體浸提液中的功能成分進行了分析。結(jié)果表明秀珍菇發(fā)酵至第6天時菌體干重達到16.53 g/L，發(fā)酵液和菌絲體浸提物中含有多糖、蛋白質(zhì)、黃酮和多酚等功能成分。經(jīng)檢測，在發(fā)酵液中，多糖、蛋白質(zhì)、黃酮和多酚的含量分別為0.672、0.052、0.126、0.122mg/mL；而菌絲體浸提液中，多糖、蛋白質(zhì)、黃酮和多酚的含量分別為0.312、0.031、0.116、0.109 mg/mL。本研究表明，秀珍菇的液態(tài)發(fā)酵可獲得較高含量的活性成分，為秀珍菇的進一步開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

秀珍菇；液態(tài)發(fā)酵；成分分析

秀珍菇又名小平菇，隸屬于側(cè)耳科側(cè)耳屬，作為人類食用的一種大型真菌，具有高蛋白、高膳食纖維、低脂肪、低能值、富含礦物質(zhì)和多種維生素等優(yōu)點，并且還含有真菌多糖、糖蛋白、生物堿等多種活性物質(zhì)[1-2]，已經(jīng)有研究證實這些活性成分具有抗癌、抗病毒、增強免疫、降低膽固醇和保肝作用[3-4]。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)可以通過控制發(fā)酵條件使培養(yǎng)環(huán)境的理化參數(shù)易于控制，便于機械化操作，規(guī)范生產(chǎn)工藝，從而實現(xiàn)生產(chǎn)的工業(yè)化[5-6]。此外，液態(tài)發(fā)酵秀珍菇菌絲體的過程中可以獲得一些代謝產(chǎn)物。之前國內(nèi)外對于秀珍菇營養(yǎng)成分的研究大多局限于子實體。而近期的研究表明，深層培養(yǎng)食用菌菌絲體的營養(yǎng)價值更高，其多糖、蛋白質(zhì)和氨基酸的含量均接近或超過了子實體[7]。因此，對秀珍菇液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的研究更具有現(xiàn)實意義，且更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試秀珍菇菌株（Pleurotus geesteranus）：由寶地農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。

沒食子酸（分析純）：北京化學(xué)試劑公司；牛血清白蛋白（分析純）：上海藍季科技發(fā)展有限公司；苯酚（分析純）、Na2HPO4·12H2O（分析純）：天津市四通化工廠；NaH2PO4·2H2O（分析純）：天津大學(xué)科威公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MA300A磁力攪拌器：日本YAMATO公司；BIOTECH-5BGZ型氣升式發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；JA2003型電子分析天平：上海精科天平廠；可見分光光度計722E：北京瑞利分析儀器公司；SM-510型全自動滅菌鍋：日本YAMATO公司；5415D型離心機：德國EPPENDORF公司。

1.3 培養(yǎng)基配制

液體發(fā)酵培養(yǎng)基（以每升計）

可溶性淀粉20 g，煮沸溶解，酵母浸粉5 g；KH2PO42 g；MgSO41 g；pH 值自然。

培養(yǎng)基滅菌條件：高壓蒸汽滅菌，121℃，20 min。

1.4 7L氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)

在前期試驗的基礎(chǔ)之上，進行7L氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)。發(fā)酵罐工作體積為5 L，通氣量為0.3 Nm3/h，發(fā)酵6 d，每24 h取樣，測定其菌絲體生物量、pH值、胞外粗多糖含量，并繪制發(fā)酵曲線。

1.5 菌絲體干重的測定

將秀珍菇發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾后，將菌絲體在60℃干燥箱中烘干至恒重。取出稱重后，減去濾紙片的重量，即為秀珍菇的菌絲體干重。

1.6 發(fā)酵液及菌體浸提液的制備

經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)獲得的秀珍菇發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)過真空抽濾，將發(fā)酵液和菌絲體分開。把菌絲體置于60℃烘箱中烘干，然后研磨呈粉末狀。稱取1 g的干菌絲體于40 mL蒸餾水中，再將其置于45℃，超聲45 min，再于 90 ℃水浴 1 h，冷卻，離心 20 min，8 000 r/min，將沉淀菌體除去，得到的上清液即為胞內(nèi)物質(zhì)的浸提液。

1.7 發(fā)酵液中胞外多糖及菌絲體中胞內(nèi)多糖的制備

將發(fā)酵液、菌體浸提液分別置于透析袋（6 000 Da～8 000 Da）透析，直至透析液中無單糖檢測出為止。

1.8 發(fā)酵液成分分析

1.8.1 苯酚-硫酸法測定秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中胞外多糖和胞內(nèi)多糖的含量[8]

取發(fā)酵培養(yǎng)第6天的秀珍菇發(fā)酵液與菌絲體浸提液，采用苯酚-硫酸法測定秀珍菇發(fā)酵液中胞外多糖和胞內(nèi)多糖的含量。

1.8.2 Bradford法測定秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量[9]

取發(fā)酵培養(yǎng)第6天的秀珍菇發(fā)酵液與菌絲體浸提液，采用Bradford法測定秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量。

1.8.3 NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法測定秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中總黃酮含量[10]

取發(fā)酵培養(yǎng)第6天的秀珍菇發(fā)酵液與菌絲體浸提液，采用NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法，測定秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中總黃酮含量。

1.8.4 Folin-Ciocaltue法測定秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中多酚含量[11]

取發(fā)酵培養(yǎng)第6天的秀珍菇發(fā)酵液與菌絲體浸提液，采用Folni-Ciocaltue法，測定秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中多酚含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 7L氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

采用搖瓶優(yōu)化的培養(yǎng)基和工藝條件，對秀珍菇進行擴大式培養(yǎng)，考察其在7L氣升式發(fā)酵罐中菌絲體生物量、胞外粗多糖和pH值隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律，具體結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 秀珍菇發(fā)酵過程中生物量、胞外粗多糖的變化Fig.1 The growth curve of submerged culture of Pleurotus geesteranus in 7 L airlift fermenter

圖2 秀珍菇發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.2 The pH curve of submerged culture of Pleurotus geesteranus in 7 L air-lift fermenter

菌絲體是生物發(fā)酵過程中的一個重要指標(biāo)，在發(fā)酵過程中，1 d～2 d菌絲體前期生長緩慢，隨后加速增加，到第6天時達到最大值16.53 g/L，隨后進入相對穩(wěn)定的階段；發(fā)酵液中胞外粗多糖隨著菌絲體生長開始代謝分泌產(chǎn)生，隨著時間延長，含量不斷增加到第6天時，達到2.23 g/L，并隨著發(fā)酵天數(shù)的延長還在增加，但當(dāng)發(fā)酵進入平穩(wěn)期時多糖產(chǎn)量的增加也趨于平穩(wěn)，增加量很小，發(fā)酵7 d時，多糖產(chǎn)量為2.35 g/L，第8天時為2.33 g/L，產(chǎn)量有所下降這與菌絲體生物量的增長趨勢一致。pH值隨著菌絲體基質(zhì)分解代謝產(chǎn)生有機酸而逐漸下降，但pH值變化波動范圍較小，從初始pH值為5.0降低到3.79；7L氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵秀珍菇周期為6 d，菌體生物量為16.53 g/L。

2.2 秀珍菇發(fā)酵液成分分析

2.2.1 秀珍菇發(fā)酵液中胞外多糖和胞內(nèi)多糖的含量

苯酚-硫酸法測定粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：以葡萄糖含量（g/L）為橫坐標(biāo)（x），OD490nm值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3）。所得方程為y=7.597 3x-0.004 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 1。在0.02 mg/mL～0.12 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖3 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of phenol-sulfuric acid method

取上述方法制備的秀珍菇發(fā)酵液與菌絲體浸提液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出秀珍菇發(fā)酵液中的多糖含量為0.672 mg/mL，菌絲體浸提液中的多糖含量為0.312 mg/mL。

2.2.2 秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量

Bradford法測蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：以牛血清白蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），OD595nm值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖4）。所得方程為y=0.007 3x+0.018 8，相關(guān)系數(shù) R2=0.997 7。在 10 μg/mL～100 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

取上述方法制備的秀珍菇發(fā)酵液與菌體浸提液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出秀珍菇發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量為0.052 mg/mL，菌絲體浸提液的蛋白質(zhì)含量為0.031 mg/mL。

2.2.3 秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中總黃酮含量

NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法測黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線：以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），OD510nm值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。所得方程為y=1.026 4x－0.011 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4。在0.1 mg/mL～0.6 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖4 Bradford法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of Bradford method

圖5 NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of NaNO3-Al（NO3）3-NaOH method

取上述方法制備的秀珍菇發(fā)酵液與菌絲體浸提液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出秀珍菇發(fā)酵液中黃酮含量為0.126 mg/mL，菌絲體中黃酮含量為0.116 mg/mL。

2.2.4 秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中總多酚含量

Folni-Ciocaltue法測多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：以沒食子酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），吸光值OD755nm值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6）。所得方程為y=13.374x+0.013 8，相關(guān)系數(shù) R2=0.998 9，在 0.01 mg/mL～0.6 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖6 Folni-Ciocaltue法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of Folni-Ciocaltue method

取上述方法制備的秀珍菇發(fā)酵液與菌絲體浸提液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出秀珍菇發(fā)酵液和菌絲體浸提液中多酚含量分別為0.122、0.109 mg/mL。

3 結(jié)論

7L氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果表明，秀珍菇發(fā)酵周期為6 d，菌絲體生物量為16.53 g/L，胞外粗多糖產(chǎn)量為2.35 g/L，發(fā)酵最終pH值為3.77。秀珍菇發(fā)酵產(chǎn)物中含有多糖、蛋白質(zhì)、黃酮和多酚等功能成分。其中，菌絲體浸提液中的多糖含量為0.312 mg/mL與熊芳[12]等測定的秀珍菇菌絲體中多糖含量0.288 mg/mL相近。發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量為0.052 mg/mL，菌體浸提液的蛋白質(zhì)含量為0.031 mg/mL。發(fā)酵液中黃酮含量為0.126 mg/mL，菌絲體中黃酮含量為0.116 mg/mL。發(fā)酵液中多酚含量為0.122 mg/mL，菌體浸提液中多酚含量為0.109 mg/mL。與趙丹等[13]測定的靈芝發(fā)酵液中多酚含量0.054 mg/mL、黃酮含量0.045 mg/mL相比，秀珍菇發(fā)酵液中的多酚和黃酮含量明顯較高。本研究結(jié)果為秀珍菇的進一步開發(fā)利用提供了一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

[1] 馮志勇,王志強,郭力剛,等．秀珍菇生物學(xué)特性研究[J].食用菌學(xué)報,2003(3):11-16

[2] 張曉玉,張博,辛廣,等．秀珍菇營養(yǎng)成分、生物活性及貯藏保鮮的研究進展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2016(6):2314-2319

[3] 李小雨,王振宇,王璐．食用菌多糖的分離、結(jié)構(gòu)及其生物活性的研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2012(12):236-240

[4] 歐陽天贄,李小定,榮建華．真菌多糖抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用研究進展[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006(3):524-528

[5] 王揚軍,陳若霞,楊勇．液體菌種培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式試驗[J]．食用菌,2006(S1):43-44

[6] 劉欣,于天穎,王?。覈秤镁S化生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢分析[J]．農(nóng)業(yè)科技與裝備,2013(12):72-73

[7] 楊梅,沈炎芬,石磊,等．秀珍菇深層培養(yǎng)條件及菌絲體氨基酸組分分析[J]．食用菌,2007(1):11-12

[8] Ing-Lung Shih,Bi-Wen Chou,Chien-Cheng Chen,et al.Study of mycelial growth and bioactive polysaccharide production in batch and fed-batch culture ofGrifola frondosa[J].Bioresource Technology,2008(99):785-793

[9] 胡朝暾,唐霞,肖震,等．茯苓發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的電泳分離與質(zhì)譜分析[J]．中草藥,2016(13):2269-2276

[10]夏林波,董倩,鄧仕任,等．中藥芫花總黃酮含量測定方法研究[J]．時珍國醫(yī)國藥,2011(9):2099-2100

[11]孫建霞,孫愛東,白衛(wèi)濱,等．蘋果中多酚物質(zhì)的抗氧化研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(3):122-124

[12]熊芳,孫淑靜,肖穎,等．6種食用菌菌絲體多糖含量的比較[J]．食品研究與開發(fā),2012(8):27-31

[13]趙丹,許丹妮,王冬冬,等.靈芝發(fā)酵液的成分檢測及美白與抗衰老功效評價[J]．日用化學(xué)工業(yè),2016(4):226-230,242

The Liquid-fermentation Cultivation and Major Active Component Analysis of Pleurotus geesteranus

GENG Wei-tao1，LI Bing-gong1，LIU Shan1，GUO Jin-ti2，LI Chao1，WANG Yan-ping1，*
（1.Insititute for New Rural Development，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Baodi Agricultural Science and Technology Development Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

In order to further developPleurotus geesteranus，the present study was carried on the culture ofPleurotus geesteranusin 7L air-lift type fermentor，and the functional constituents in the fermentation broth and mycelium extract were analyzed.The results showed that the dry weight of mycelium reached 16.53 g/L at the 6th day，and the polysaccharide，protein，flavone and polyphenol were found in the fermentation broth and mycelium extract.The results showed that the contents of polysaccharides，proteins，flavones and polyphenols in the fermentation broth were 0.672，0.052，0.126，0.122 mg/mL，respectively.And the corresponding contents of the four functional components were 0.312，0.031，0.116，0.109 mg/mL in the mycelium extracts respectively.The results showed that the liquid fermentation ofPleurotus geesteranuscould obtain high content of active components，which provided the theoretical basis and technical support for the further development and utilization ofPleurotus geesteranus.

Pleurotus geesteranus；liquid fermentation；component analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.039

天津市科技計劃項目（13ZCZDNC06500）；天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院開放基金資助項目（xnc201509）

耿偉濤（1985—），男（漢），講師，博士研究生，研究方向：食品微生物。

*通信作者：王艷萍（1962—），女，教授，博士研究生，研究方向：食品微生物。

2017-03-03