安傳相，畢遠(yuǎn)林，裴璞花，馬立志，2，*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽(yáng)550005）

響應(yīng)面法對(duì)核桃粕中蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化

安傳相1，畢遠(yuǎn)林1，裴璞花1，馬立志1，2，*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽(yáng)550005）

核桃蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)平衡的蛋白質(zhì)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與動(dòng)物蛋白相近。采用微波輔助NaOH提取核桃粕中的蛋白質(zhì)，研究液料比、NaOH濃度、溫度、時(shí)間各單因素對(duì)核桃蛋白提取率影響。在單因素篩選的條件下，利用響應(yīng)面優(yōu)化核桃粕中蛋白質(zhì)的提取工藝，確定較佳的提取工藝條件：液料比40∶1（mL/g）、NaOH濃度0.08%、提取溫度58℃、時(shí)間110 min，核桃蛋白提取率高達(dá)56.51%。

響應(yīng)面；核桃；超聲波；蛋白質(zhì)

核桃（Juglans regiaL.）又名胡桃、羌桃，系胡桃科核桃屬植物[1]。它與扁桃、腰果、榛子并列為世界四大干果[2]。核桃中核桃仁的油脂含量高達(dá)65%左右，其中大部分為不飽和脂肪酸，主要由軟脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸組成，另外核桃仁中還含有約15%的蛋白質(zhì)[3]。蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。其作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，擔(dān)負(fù)著新陳代謝、免疫保護(hù)和酶的催化等多種生理功能，并在生物體的生命活動(dòng)和幾乎所有的生物過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值取決于其中氨基酸的種類和含量。核桃蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白，含有18種氨基酸，其中含有8種人體所必需的氨基酸，8種必需氨基酸的含量比例合理，接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸配比[5]。近年來已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了核桃粕中蛋白質(zhì)的提取工藝[6-7]，但提取率相對(duì)較低，不能有效的利用核桃粕中的蛋白質(zhì)，造成寶貴資源的浪費(fèi)。因此本研究以核桃粕為原料，應(yīng)用超聲波對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行輔助提取，為開發(fā)核桃蛋白產(chǎn)品，對(duì)實(shí)現(xiàn)核桃粕的綜合利用、提高副產(chǎn)物的附加值以及延長(zhǎng)核桃產(chǎn)業(yè)鏈具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

1.1.1.1 原材料

核桃（黔產(chǎn)5號(hào)）：貴州省畢節(jié)市赫章縣產(chǎn)。

1.1.1.2 化學(xué)試劑

考馬斯亮蘭G-250：天津市登科化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白：北京中生瑞泰科技有限公司；氫氧化鈉：成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅：宜興市化學(xué)試劑廠；硫酸鉀：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；硼酸：天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；甲基紅、亞甲基藍(lán)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸：北京化工廠；85%磷酸：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；95%乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

6YZ-180液壓榨油機(jī)：河南源通機(jī)械設(shè)備有限公司；FA2104萬(wàn)分之一電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；DL-5-B飛鴿牌系列離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；WBZ-PPLC智能靜態(tài)微波真空干燥機(jī)：南京杰全微波設(shè)備有限公司；PHB-4雷磁牌數(shù)字型PH計(jì)：上海精科雷磁公司；KQ-500DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)：島津公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

采用凱氏定氮法（GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》）。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1）考馬斯亮蘭G-250試劑的制備[8-9]。

2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（0.1 mg/mL）：稱取 10 mg牛血清蛋白（Albumin from bovine serum，BSA），用蒸餾水定容至100 mL。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程的建立[10]。

1.2.3 核桃蛋白提取率的測(cè)定

蛋白質(zhì)的提取率以浸出率為指標(biāo)，蛋白質(zhì)浸出率按照以下公式計(jì)算。

式中：X 為浸出率，%；M1為核桃粕質(zhì)量，g；M2為浸出的蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素對(duì)核桃蛋白提取的影響

分別以不同的提取方式、液料比、NaOH濃度、提取溫度及時(shí)間為單因素，考察各因素對(duì)核桃蛋白提取率的影響。

1.2.4.1 浸提方式對(duì)核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），溫度40℃，0.08%NaOH溶液，分別采用常溫、水浴、磁力攪拌器和超聲波的方法分別對(duì)脫脂核桃粕浸提70 min，4 000 r/min離心20 min，去油層及沉淀并過濾，取0.5 mL濾液定容100 mL。以蛋白質(zhì)浸出率為指標(biāo)，確定較佳的提取方式。

1.2.4.2 料液比對(duì)核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在溫度40℃，0.08%NaOH 溶液，分別按液料比為 20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1（mL/g）的條件下對(duì)核桃粉超聲波浸提70 min，4 000 r/min離心20 min，確定料液比對(duì)提取核桃蛋白率的影響。

1.2.4.3 NaOH濃度對(duì)核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），溫度40℃，分別用0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%NaOH溶液超聲波方法浸提70 min，4 000 r/min離心20 min，并測(cè)定蛋白質(zhì)的含量以蛋白質(zhì)浸出率為指標(biāo)，確定NaOH溶液濃度對(duì)提取核桃蛋白率的影響。

1.2.4.4 溫度對(duì)核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），NaOH 溶液濃度 0.08%、溫度分別為 30、40、50、60、70、80℃條件下用超聲波方法浸提70 min，4 000 r/min離心20 min，確定浸提溫度對(duì)提取核桃蛋白率的影響。

1.2.4.5 時(shí)間對(duì)核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），溫度40℃，0.08%NaOH溶液，采用超聲波輔助的方法分別對(duì)脫脂核桃粕浸提30、50、70、90、110、130 min，4 000 r/min離心20 min，以蛋白質(zhì)浸出率為指標(biāo)，確定浸提時(shí)間對(duì)提取核桃蛋白率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化核桃蛋白的提取

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert8.0軟件程序根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平，以核桃蛋白的提取率為響應(yīng)值，對(duì)核桃蛋白提取條件進(jìn)行優(yōu)化。因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels coding table

1.2.6 驗(yàn)證性試驗(yàn)

在響應(yīng)面優(yōu)化條件下，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，與理論預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，以驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

蛋白質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 蛋白質(zhì)含量Table 2 The content of protein

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性關(guān)系良好。此標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=5.512 6x+0.013 1，R2=0.996 7，說明牛血清蛋白（Albumin from bovine serum）在0~0.1 mg/mL范圍內(nèi)所呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同的輔助方式對(duì)核桃蛋白提取率的影響

不同的輔助方式對(duì)核桃蛋白提取率的影響見表3。

表3 不同的輔助方式對(duì)核桃蛋白提取率的影響Table 3 Effect of different assistant methods on the extraction rate of walnut protein

由表3可知，采用超聲波進(jìn)行輔助提取時(shí)，核桃蛋白的提取率最高，可以達(dá)到33.51%，其他輔助提取方式都較小。故選取超聲波作為核桃蛋白的輔助提取方式，在以下試驗(yàn)中，均以超聲波為核桃蛋白的輔助提取方式。

2.3.2 液料比對(duì)核桃蛋白提取率的影響

液料比對(duì)核桃蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on extraction rate

從圖2可知，在一定的范圍內(nèi)，液料比越大，越利于蛋白質(zhì)的溶解。當(dāng)達(dá)到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)的溶出率達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。若提取液的體積大，增加后續(xù)離心工作量。當(dāng)液料比達(dá)到40∶1（mL/g）時(shí)核桃蛋白的提取率不再明顯提高，綜合考慮，選擇料液比30∶1、40∶1、50 ∶1（mL/g）3 個(gè)水平。

2.3.3 NaOH濃度對(duì)核桃蛋白提取率的影響

改變NaOH的濃度，核桃蛋白提取率變化如圖3所示。

圖3 NaOH濃度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of NaOH concentration on extraction rate

當(dāng)濃度高于0.08%時(shí)，核桃蛋白的提取率反而下降。是由于堿性太強(qiáng)會(huì)使蛋白質(zhì)變性，而且還會(huì)產(chǎn)生異味，因此NaOH的濃度在0.08%左右比較合適。

2.3.4 溫度對(duì)核桃蛋白提取率的影響

溫度對(duì)核桃蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 溫度對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction rate

從圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高提取率升高，當(dāng)溫度超過60℃時(shí)，提取率開始下降，是由于核桃蛋白的變性溫度為67℃左右[11]，超過這個(gè)溫度提取率會(huì)大大降低，因而核桃蛋白最佳提取溫度應(yīng)控制在60℃左右。

2.3.5 時(shí)間對(duì)核桃蛋白提取率的影響

時(shí)間對(duì)核桃蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of time on extraction rate

從圖5可以看出，提取時(shí)間越長(zhǎng)，核桃蛋白的提取率越高，當(dāng)提取時(shí)間超過110 min后提取率則不再明顯提高。為了提高工作效率，核桃蛋白的提取時(shí)間應(yīng)控制在110 min內(nèi)。

2.3.6 響應(yīng)面模型的建立

Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表4。Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析見表5。

表4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 4 The results of Box-Behnken response surface design

續(xù)表4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Continue table 4 The results of Box-Behnken response surface design

表5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 5 Analysis of variance of Box-Behnken response surface design

利用Design-Expert8.0進(jìn)行二次多元回歸擬合，可得液料比（A）、濃度（B）、溫度（C）以及時(shí)間（D）與響應(yīng)值提取率（Y）的關(guān)系。其多元二次回歸方程為：Y=56.13+2.15A-0.67B-2.44C-0.85D-0.37AB+1.72AC-0.61AD+1.44BC-0.17BD+0.85CD-7.70A2-2.25B2-9.80C2-11.83D2。

由表5的方差分析結(jié)果可知，方程模型的p＜0.000 1＜0.01，表明該方程模型極顯著。模型失擬項(xiàng)P=0.147 7＞0.05，表明響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，試驗(yàn)誤差小，因此，可以使用該數(shù)學(xué)模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。一次項(xiàng)中A影響極顯著（p＜0.01）、B和C的影響顯著、D影響不顯著，各因素對(duì)核桃蛋白提取率的影響由大到小依次為液料比＞溫度＞濃度＞時(shí)間。

響應(yīng)面與等高線圖見圖6～圖10。

圖7 Y=f（A，C）的響應(yīng)面與等高線Fig.7 Response surface and contour of Y=f（A，C）

圖8 Y=f（A，D）的響應(yīng)面與等高線Fig.8 Response surface and contour of Y=f（A，D）

圖9 Y=f（B，C）的響應(yīng)面與等高線Fig.9 Response surface and contour of Y=f（B，C）

圖10 Y=f（B，D）的響應(yīng)面與等高線Fig.10 Response surface and contour of Y=f（B，D）

由圖6～10的響應(yīng)面與等高線分析，所有交互項(xiàng)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響都不顯著。每個(gè)影響因子對(duì)于核桃蛋白提取率都有一個(gè)最佳穩(wěn)定條件，試驗(yàn)得到的最佳組合為：液料比 41.13∶1（mL/g）、NaOH 濃度0.08%、提取溫度58.74℃、時(shí)間109.33 min，此時(shí)，模型預(yù)測(cè)的核桃蛋白最大提取率為56.51%。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果，并為了實(shí)際操作方便操作，實(shí)際取值液料比 40∶1（mL/g）、NaOH 濃度 0.08%、提取溫度58℃、時(shí)間110 min，在此工藝條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得蛋白質(zhì)提取率的平均值為55.46%，比預(yù)測(cè)值相差1.05%，說明模型能夠用于預(yù)測(cè)核桃粕蛋白質(zhì)提取工藝參數(shù)。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)超聲波輔助提取核桃蛋白進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)確定堿溶酸沉法提取核桃粕中蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為：液料比 40 ∶1（mL/g）、濃度 0.08%、提取溫度58℃、時(shí)間110 min，此時(shí)，核桃蛋白提取率高達(dá)56.51%。因此，響應(yīng)面分析法為優(yōu)化核桃蛋白提取工藝提供理論依據(jù)，為后續(xù)對(duì)核桃粕中蛋白質(zhì)的合理開發(fā)利用提供參考意見。

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Optimization of Extraction Technology of Protein from Walnut Meal by Response Surface Methodology

AN Chuan-xiang1，BI Yuan-lin1，PEI Pu-hua1，MA Li-zhi1，2，*
（1.Wine and Food Engineering College of Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Food and Pharmaceutical Engineering Institute of Guiyang University，Guizhou Engineering Research Center for Fruit Processing，Guiyang 550005，Guizhou，China）

Walnut protein is a balanced protein，it's nutritional value is similar with that of animal protein.Present work employed NaOH assisted by ultrasonic to extract the protein in walnut meal，and the effect of single factor like liquid material ratio，NaOH concentration，temperature and time had been studied.Under the condition of single factor screening，the extraction process of protein in walnut meal was optimized by response surface methodology，the results showed that the optimum extraction conditions of walnut protein were as follows：the liquid-solid ratio 40∶1（mL/g），the concentration of 0.08%，extraction temperature 58℃and extraction time 110 min，the maximum extraction rate of walnut protein was 56.51%.

response surface；walnut；ultrasonic；protein

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.008

貴州省農(nóng)業(yè)公關(guān)項(xiàng)目（黔科合支撐[2016]2539號(hào)）；貴州省果品加工、貯藏與安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心（黔教合協(xié)同中心字[201306]號(hào)）；貴州省教育廳重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)（黔學(xué)位合字ZDXK[2014]13號(hào)）

安傳相（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

*通信作者：馬立志（1964—），男，教授，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏方向研究。

2017-03-21