胡仲義 付 濤 何月秋 李 文 林 立

(寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧波 315502)

鐵皮石斛EST-SSR引物的評價(jià)、甄選與應(yīng)用研究

胡仲義 付 濤 何月秋 李 文 林 立

(寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧波 315502)

開發(fā)、評價(jià)已篩選的鐵皮石斛EST-SSR引物，并探討其在遺傳多樣性、物種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系鑒定等方面應(yīng)用。利用前期篩選的20對多態(tài)性較好的引物用于16份材料(15份鐵皮石斛與1份串珠石斛)的聚丙烯酰氨凝膠電泳，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶。采用PopGen32軟件進(jìn)行Nei’s基因多樣度和Simpson指數(shù)等多態(tài)性指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)，分析單個(gè)引物和組合引物的區(qū)分率，之后采用NTSYSpc2.1軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)聚類圖的構(gòu)建。結(jié)果表明，引物DN4等16對引物多態(tài)性較高，而DN13、DN23、DN60和DN67多態(tài)性較低。單個(gè)引物均不能將所有供試樣品區(qū)分開來，其中DN4、DN10、DN105、DN81、DN39和DN71區(qū)分率相對較高；利用組合引物能夠?qū)⑺袠悠愤M(jìn)行有效區(qū)分，其中DN4+DN10+DN105+DN39引物組合可作為核心引物予以使用，可用于鐵皮石斛指紋圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性分析。聚類分析結(jié)果表明，該20對引物可以較好地應(yīng)用于鐵皮石斛種內(nèi)、種間親緣關(guān)系的鑒定。此外，引物DN4、DN13、DN39、DN58、DN65、DN67、DN10和DN99可用于鐵皮石斛與串珠石斛的鑒定。本研究開發(fā)的20對引物可較好地應(yīng)用于鐵皮石斛遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等方面，具有廣泛的應(yīng)用性。

鐵皮石斛；分子標(biāo)記；EST-SSR；引物評價(jià)；應(yīng)用研究

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)又名“耳環(huán)石斛”，為我國名貴中藥材，在我國長期具有“仙草”的美譽(yù)，目前，市場上多以其干品—鐵皮楓斗出售，尤以外觀呈“龍頭鳳尾”者為最優(yōu)。鐵皮石斛含有多糖、生物堿、黃酮類和氨基酸等多種生物活性成分，具有抗衰老、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等作用[1～2]。鐵皮石斛分布較廣，東亞、東南亞及澳大利亞等國家和地區(qū)均有分布，在我國主要分布于安徽、浙江、貴州、云南和廣西等地，其中在浙江東部的仙居、天臺(tái)和鄞縣也有野生資源的分布。然而由于近年來人類無節(jié)制、掠奪性地濫采、亂用，其野生資源受到極大破壞，已瀕臨滅絕[3]。浙江省是首先開發(fā)鐵皮石斛保健產(chǎn)品并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的省份之一。目前，浙江省從原料種植到加工生產(chǎn)保健產(chǎn)品，形成了完整的產(chǎn)業(yè)鏈，初具一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模。鐵皮石斛已實(shí)現(xiàn)了組培快繁栽培，形成了“公司(企業(yè))加基地”為主的種植模式。

EST-SSR標(biāo)記不僅具有基因組SSR標(biāo)記中技術(shù)簡單、重復(fù)性好、多態(tài)性高和共顯性遺傳等特點(diǎn)，還具有引物開發(fā)廉價(jià)、通用性較好、條帶清楚、容易統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)[4]。此外，由于EST-SSR是編碼基因的一部分，能夠直接獲得基因表達(dá)的相關(guān)信息，這有可能直接鑒定決定重要表型性狀的等位基因[5]。隨著NCBI中EST數(shù)據(jù)庫不斷地豐富與完善，使用其序列開發(fā)SSR標(biāo)記也已成為一種十分簡便而有效的方法，時(shí)至今日，EST-SSR標(biāo)記已在眾多植物中得到廣泛的應(yīng)用[6]。目前，石斛屬(Dendrobium)植物的DNA分子鑒定方面主要采用RAPD、AFLP、ISSR、SRAP和SSR等分子標(biāo)記技術(shù)，如苑鶴等[7]利用RAPD對人工栽培鐵皮石斛居群的遺傳多樣性進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與其地理種源具有顯著的相關(guān)性，而與栽培地點(diǎn)無關(guān)；王慧中等[8]利用AFLP對13種石斛屬植物進(jìn)行了遺傳多樣性的分析，其結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)的結(jié)果基本一致；李明焱等[9]利用ISSR進(jìn)行了鐵皮石斛新品種的選育工作；樊洪泓等[10]利用SRAP對藥用石斛的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)研究；邱道壽等[11]對石斛屬植物進(jìn)行了SSR標(biāo)記的開發(fā)及可轉(zhuǎn)移性分析。但至目前為止，有關(guān)鐵皮石斛的EST-SSR標(biāo)記卻極少見于報(bào)道。本文利用本課題組前期開發(fā)的鐵皮石斛EST-SSR引物用于鐵皮石斛種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系鑒定和指紋圖譜構(gòu)建等方面。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究共采集15份鐵皮石斛和1份串珠石斛，由于部分還未被認(rèn)定為新品種，故本文以代碼(DO-1～DO-16；DO-5為串珠石斛，作為外類群)代替，其中DO-8、DO-9、DO-15、DO-14和DO-16均采自浙江省寧波市寧波華夏生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所；DO-2采自云南思茅；DO-1、DO-3、DO-4、DO-5、DO-6、DO-7和DO-13采自浙江省臺(tái)州市浙江鳳凰源生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；DO-10、DO-11和DO-12分別采自浙江溫州雁蕩山、云南紅河和浙江麗水。樣品信息及其來源(原產(chǎn)地)具體詳見表1。

表1鐵皮石斛樣品信息及其來源

Table1SamplesinformationandsourceinD.officinale

編號No.原產(chǎn)地OriginDO-1廣東饒平RaopingGuangdongDO-2云南思茅SimaoYunnanDO-3安徽合肥HefeiAnhuiDO-4福建龍巖LongyanFujianDO-5浙江溫州WenzhouZhejiangDO-6福建武夷山Wuyimountain,FujianDO-7湖南新寧崀山Langshan,XinningHunanDO-8浙江瑞安RuianZhejiangDO-9浙江蕭山XiaoshanZhejiangDO-10浙江溫嶺雁蕩山Y(jié)andangmountain,WenlingZhejiangDO-11云南紅河Honghe,YunnanDO-12浙江麗水LishuiZhejiangDO-13云南文山WenshanYunnanDO-14浙江富陽FuyangZhejiangDO-15浙江臨安LinanZhejiangDO-16浙江富陽FuyangZhejiang

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織培養(yǎng)

將成熟未開裂的鐵皮石斛蒴果在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精進(jìn)行表面消毒，剪開蒴果端部，用鑷子輕輕敲擊蒴果基部，鐵皮石斛種子接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.05 mg·L-1+30 g·L-1糖+pH5.8中，一個(gè)月后種子即可萌發(fā)。此時(shí)，轉(zhuǎn)移至1/2MS+NAA0.05 mg·L-1+30 g·L-1糖+香蕉汁100 g·L-1+pH5.8進(jìn)行增殖和生長，以后每兩個(gè)月轉(zhuǎn)接至同樣的培養(yǎng)基中，直至組培苗長至2 cm。最后轉(zhuǎn)移至1/2MS+NAA0.05 mg·L-1+30 g·L-1糖+香蕉汁100 g·L-1+pH5.8+0.05%AC+花寶1號1 g·L-1壯苗和生根培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月即可長成5 cm的優(yōu)質(zhì)苗。采集嫩葉用于DNA的提取。

1.2.2 基因組DNA提取

采用植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)進(jìn)行鐵皮石斛DNA的提取，利用Bio-Photometr核酸檢測儀(德國Eppendorf公司)檢測DNA的濃度和純度，之后再依據(jù)所得的DNA濃度，用預(yù)熱的TE溶液將DNA樣品溶液稀釋成50 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 EST-SSR引物信息

本課題組前期利用NCBI中鐵皮石斛近緣種—金釵石斛的EST序列合成了106對引物，通過電泳檢測，篩選獲得了多態(tài)性較高的43對引物，該43對引物普帶清晰、多態(tài)性較好。本試驗(yàn)從該43對引物中選擇其中最好的20對引物用于不同種質(zhì)(產(chǎn)地)鐵皮石斛遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定等方面的應(yīng)用(表2)。

表2 20對EST-SSR引物相關(guān)信息

1.2.4 PCR擴(kuò)增

在Mastercycler普通梯度PCR儀(德國Eppendorf公司生產(chǎn))進(jìn)行引物最適復(fù)性溫度的篩選。2×Taq PCR MasterMix購自天根生物公司(北京)，PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括：10 μL的2×Taq PCR MasterMix(含有Taq酶、dNTP和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液)，0.4 μL的模板DNA(50 ng·μL-1)，0.8 μL的引物對(5 μmol·μL-1)×2，8 μL的ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s，復(fù)性(48～64℃)30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸7 min，4℃保存。在最適退火溫度下，對16份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，銀染，膠干后利用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照、保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

觀察各SSR位點(diǎn)在供試樣本間PCR擴(kuò)增條帶的差異,清晰帶賦值為“1”，無擴(kuò)增帶的賦值為“0”,用Excel軟件統(tǒng)計(jì)整理。采用PopGen32軟件計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率、Nei’s基因多樣度和Simpson指數(shù)等指標(biāo)。采用NTSYSpc2.1軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并采用UPGMA法構(gòu)建聚類分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物多態(tài)性指標(biāo)分析

由表3可知，20對引物在16份材料(圖1)中共擴(kuò)增出79條帶，其范圍為1～11條，大多數(shù)范圍在2～5條，平均每條引物擴(kuò)增出3.95條；其中多態(tài)性條帶有73條，平均每條引物擴(kuò)增出3.65條多態(tài)性條帶。平均多態(tài)性百分率為93.33%，其中DN5多態(tài)性百分率最低，為50%；DN4、 DN10、

DN13、DN29、DN39、DN57、DN58、DN65、DN67、DN71、DN81、DN95、DN99和DN106多態(tài)性百分率均為100%(DN67僅擴(kuò)增出1條帶，在鐵皮石斛不同種質(zhì)間無差異，均有1條帶，但在串珠石斛中無帶)；其余引物多態(tài)性百分率介于50%～100%。

表320對引物的擴(kuò)增結(jié)果

Table3Amplificationefficiencyof20pairsofprimer

引物Primers總帶數(shù)Totalbandnumber多態(tài)性位點(diǎn)Polymorphicloci多態(tài)性比例Polymorphismproportion(%)Nei’s基因多樣度Nei’sgenediversityShannon’s信息指數(shù)Shannon’sinformationindexDN4771000.34040.5156DN521500.25000.3466DN1011111000.30110.4633DN13221000.16800.3053DN2354800.17660.2931DN29441000.35740.5298DN39551000.28280.4411DN4643750.22460.3554DN57221000.33980.5225DN58331000.36720.5348DN6043750.18160.2997DN65221000.37500.5623DN67111000.11720.2338DN71331000.32550.4920DN81881000.30660.4682DN923266.70.31250.4410DN95221000.29690.4696DN99441000.36520.5377DN10554800.25620.3955DN106221000.42970.6211總計(jì)Total7973———平均Average3.953.6591.330.28870.4414

圖1 16份材料的組培苗 上排一列從左至右依次為DO-1～DO-8；下排一列從左至右依次為DO-9～DO-16。Fig.1 The tissue culture seedlings of 16 materials A row of columns from left to right:DO-1～DO-8;the lower row from left to right:DO-9～DO-16.

此外，每對引物的Nei’s基因多樣度范圍為0.117 2～0.429 7，均值為0.288 7，小于0.2的有DN13、DN23、DN60和DN67，介于0.2～0.3的有DN5、DN39、DN46、DN95和DN105，其余均大于0.3；Shannon’s信息指數(shù)范圍為0.233 8～0.621 1，均值為0.441 4，小于0.3的有DN23、DN60和DN67，介于0.3～0.4的有DN5、DN23、DN46和DN105，其余均大于0.4。綜合結(jié)果表明，理論上，DN13、DN23、DN60和DN67引物多態(tài)性水平過低，其應(yīng)用性可能較弱，而其余16對引物多態(tài)性水平卻相對較高，理論上可較好地應(yīng)用于不同種質(zhì)鐵皮石斛的遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建以及功能基因研究等方面，但這均有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

2.2 單個(gè)EST-SSR引物的區(qū)分率分析

由表4可知，20對引物中無任何一個(gè)引物能將16份供試材料全部一次性區(qū)分開來。20對引物的最大相似性系數(shù)均為1.00；引物DN4劃分組數(shù)(13組)和直接鑒定出的材料數(shù)(11個(gè))均為最多，聚類區(qū)分率也最大(68.75%)，鑒別能力最強(qiáng)；其次為引物DN10，劃分組數(shù)為12組，直接鑒定出的材料數(shù)為9個(gè)，聚類區(qū)分率為56.25%；引物DN105劃分組數(shù)為7組，直接鑒定出的材料數(shù)為5

個(gè)，聚類區(qū)分率為31.25%。其它引物則可將16份供試材料劃分為2～6組，可以直接區(qū)分的材料數(shù)0～3個(gè)，聚類區(qū)分率0～18.75%。該20對引物只有通過組合方式才能將以上16份供試材料一次性區(qū)分開。圖2為部分引物的擴(kuò)增圖譜。

圖2 部分引物在16份供試材料中的擴(kuò)增Fig.2 Polymorphisms showed in 16 materials by partial primers

引物Primers分組數(shù)Numberofgroup直接鑒定材料數(shù)Numberofidentificationmaterialdirectly直接鑒定材料編號Serialnomberofidentificationmaterialdirectly最大相似性系數(shù)Thebiggestgeneticsimilarity區(qū)分率Rateofdistinguishingbycluster(%)DN41311DO2-DO9、DO11、DO12和DO161.0068.75DN520無No1.000DN10129DO1、DO2、DO5-DO9、DO11和DO151.0056.25DN1331DO51.006.25DN2341DO51.006.25DN2941DO21.006.25DN3963DO5、DO11和DO141.0018.75DN4641DO41.006.25DN5731DO41.006.25DN5841DO51.006.25DN6031DO91.006.25DN6541DO51.006.25DN6721DO51.006.25DN7142DO4和DO51.0012.50DN8163DO3、DO4和DO71.0018.75DN9220無No1.000DN9530無No1.000DN9961DO51.006.25DN10575DO4、DO9和DO13-DO151.0031.25DN10620無No1.000

2.3 組合EST-SSR引物的區(qū)分率分析

選擇分組數(shù)+直接鑒定材料數(shù)≥6的引物作為組合引物的首選備選引物，由表5可知，引物DN4、DN10和DN105兩兩組合中DN4+DN10的組合鑒定效果較好，在最大相似系數(shù)0.94處DO12和DO13區(qū)分不開；DN4+DN10+DN105組合在0.91處DO8和DO16、DO12和DO13區(qū)分不開；此后在DN4+DN10+DN105組合的基礎(chǔ)上逐漸增加其它引物直到全部20對引物的組合，在最大相似系數(shù)為0.93～0.95處，DO8和DO16始終區(qū)分不開，DN4+DN10+DN105+DN39組合之后，再增加引物數(shù)量DO8和DO16均區(qū)分不開，因此建議將DN4+DN10+DN105+DN39引物組合作為鑒定鐵皮石斛種質(zhì)資源的EST-SSR核心引物予以使用，可直接用于鐵皮石斛不同種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建等方面。圖3為引物DN4、DN10、DN105、DN39分別在16份供試材料中的指紋圖譜。

圖3 4對核心引物在16份供試材料中的擴(kuò)增Fig.3 Polymorphisms showed in 16 materials by 4 pairs of core primers

引物Primers分組數(shù)Nomberofgroup直接鑒定材料數(shù)Nomberofidentificationmaterialdirectly親緣關(guān)系最近的材料編號Serialnomberofrecentgeneticrelationships最大相似性系數(shù)Thebiggestgeneticsimilarity區(qū)分率Rateofdistinguishingbycluster(%)DN4、101515DO12和DO130.94100DN4、1051514DO1和DO101.0087.50DN10、1051415DO2和DO16、DO3和DO130.94100DN4、10、1051415DO8和DO16、DO12和DO130.91100DN4、10、81、1051415DO8和DO16、DO12和DO130.95100DN4、10、39、1051515DO8和DO160.93100DN4、10、39、81、1051515DO8和DO160.94100DN4、10、39、71、81、1051515DO8和DO160.95100DN4、10、39、71、81、99、1051515DO8和DO160.95100……1515DO8和DO16……100全部20對引物All20pairsofprimers1515DO8和DO160.95100

2.4 鑒定鐵皮石斛與串珠石斛的引物篩選

由圖3～4可知，引物DN4、DN13、DN39、DN58、DN65和DN67對串珠石斛無擴(kuò)增片段，而對15份不同種質(zhì)的鐵皮石斛均有不同大小的擴(kuò)增片段。引物DN99和DN10對串珠石斛均有單一擴(kuò)增片段，引物DN10擴(kuò)增片段大小約400 bp，明顯大于在15份鐵皮石斛中的擴(kuò)增片段的大小(圖1:Dn-10)；引物DN99擴(kuò)增片段大小約150 bp，明顯小于在15份鐵皮石斛中的擴(kuò)增片段的大小(圖1:Dn-99)。因此，引物DN4、DN13、DN39、DN58、DN65、DN67、DN10和DN99可作為鑒定鐵皮石斛與串珠石斛的引物。目前市場上鐵皮石斛干品—鐵皮楓斗混偽品較多，從外形上難以區(qū)分，可利用該些引物鑒定其中是否混有串珠石斛。

2.5 聚類分析

依據(jù)20對EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果，再利用NTSYSpc2.10e軟件進(jìn)行Jaccard相似性系數(shù)分析，計(jì)算出它們之間的遺傳相似系數(shù)，其中，15份鐵皮石斛(去除DO5)其范圍在0.582～0.949，串珠石斛(DO5)與15份鐵皮石斛之間的范圍在0.456～0.709(表6)。

表6 16份材料SSR分析的遺傳相似系數(shù)

圖4 引物DN13、DN58、DN65和DN67在16份供試材料中的擴(kuò)增Fig.4 Polymorphisms showed in 16 materials by primers DN13,DN58,DN65,DN67

圖5 基于SSR結(jié)果構(gòu)建的16份材料的UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA dendrogram of the 16 materials based on SSR results

由遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建了15份鐵皮石斛和1份串珠石斛的遺傳關(guān)系圖(圖5)。其中在15份鐵皮石斛中DO8和DO16號遺傳相似系數(shù)最大，為0.949；DO9和DO12、DO13遺傳相似系數(shù)最小，為0.582。串珠石斛(DO5)與DO8遺傳相似系數(shù)最大(0.709)，與DO4遺傳相似系數(shù)最小(0.456)。由圖4可知，大約在遺傳相似系數(shù)0.58處，串珠石斛被從鐵皮石斛中首先分離出來；大約在遺傳相似系數(shù)0.68處，15份鐵皮石斛被分為3大類。

第一類包括DO9、DO10、DO14和DO15；第二類僅包括DO4；第三類包括DO1、DO11、DO2、DO3、DO7、DO6、DO13、DO12、DO8和DO16。其中大約在0.77處第三類又可分為三小類，第一小類包括DO1、DO11和DO2；第二小類包括DO3、DO7、DO6、DO13和DO12；第三小類包括DO8和DO16。

3 討論

如今EST-SSR已廣泛應(yīng)用于果樹如蘋果[12]、梨[13]、杏[14]、甜瓜[15]、草莓[16]、獼猴桃[17]、荔枝[18]等，作物如大麥[19]、小麥[20]、芝麻[21]、棉花[22]、茶樹[23]、杜仲[24]等。本研究利用前期從金釵石斛EST序列中獲得的20對譜帶清晰、多態(tài)性好的EST-SSR引物用于鐵皮石斛指紋圖譜構(gòu)建的核心引物篩選、物種鑒定、遺傳多樣性分析和不同種質(zhì)親緣關(guān)系鑒定等應(yīng)用方面。

Nei’s基因多樣度與Shannon’s信息指數(shù)均是反映引物多態(tài)性水平高低的指標(biāo)，數(shù)值越大其多態(tài)性水平越高[25]，但其數(shù)值的大小卻與所檢測材料遺傳多樣性和EST-SSR標(biāo)記的鑒別力等有關(guān)[26]。本研究中Nei’s基因多樣度范圍為0.117 2～0.429 7，均值為0.288 7；Shannon’s信息指數(shù)范圍為0.233 8～0.621 1，均值為0.441 4。略低于豬苓[27]的Nei’s(0.39)和Shannon’s信息指數(shù)(0.57)，略高于荔枝[18]的Nei’s(0.270)和Shannon’s信息指數(shù)(0.425)，但總體而言，各引物所表現(xiàn)出的多態(tài)信息含量都相對較低，這可能有2方面的原因，一方面與EST-SSR標(biāo)記本身的特性有關(guān)，與Genomic-SSR相比，其轉(zhuǎn)移性高，多態(tài)性卻較低；另一方面與所檢測鐵皮石斛的種質(zhì)資源遺傳有關(guān)。研究結(jié)果表明，DN4、DN10、DN29、DN57、DN58、DN65、DN71、DN81、DN92、DN99和DN106多態(tài)性相對較高(Nei’s≥0.3)；DN5、DN39、DN46、DN95和DN105次之(0.2≤Nei’s<0.3)；DN13、DN23、DN60和DN67最低(Nei’s<0.2)。其中單個(gè)引物區(qū)分率較高的有DN4(68.75%)、DN10(56.25%)、DN105(31.25%)、DN81(18.75%)、DN39(18.75%)和DN71(12.50%)；而引物DN5、DN92、DN95和DN106區(qū)分率為0；其余引物區(qū)分率均為6.25%。這一方面說明多態(tài)性高的引物其品種區(qū)分率就高，如DN4、DN10、DN71和DN81等引物；但另一方面部分引物多態(tài)性較高，如DN106、DN92、DN95和DN5，其區(qū)分率為0，而多態(tài)性相對較低的引物，如DN13、DN23、DN60和DN67，卻有一定的區(qū)分率。造成上述矛盾的原因可能有3方面，其一，本文添加了外類群—串珠石斛(DO5)，其中DN13、DN23和DN67均是只能鑒定出串珠石斛，這對本文區(qū)分率的統(tǒng)計(jì)有一定的影響；其二，有的引物擴(kuò)增出的條帶中有部分品種條帶完全一致或基本一致，如一些擴(kuò)增條帶總數(shù)比較少的引物(DN106、DN92、DN95和DN5)，這就使得獲得的分組數(shù)較少，能直接鑒定的品種數(shù)就越少，造成單個(gè)引物的品種區(qū)分率較低，甚至為0；其三，本研究試驗(yàn)材料過少對試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)也有一定的影響?；谏鲜鲈?，多態(tài)性較高的引物其品種區(qū)分率可能不高，而多態(tài)性較低的引物卻可能有一定的區(qū)分率(該類引物多可作為特異性引物，如DN13和DN67可作為鑒定鐵皮石斛和串珠石斛的引物)，因此要能夠最大限度的將所有樣品進(jìn)行有效區(qū)分，還需進(jìn)行引物的組合試驗(yàn)。

本文選擇分組數(shù)+直接鑒定材料數(shù)≥6的引物作為組合引物的首選備選引物，符合要求的引物有DN4、DN10、DN39、DN71、DN81、DN99和DN105，通過不同的組合試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DN4+DN10+DN105+DN39組合可將16份材料進(jìn)行有效區(qū)分，之后再增加其它引物也無法再將彼此親緣關(guān)系最近的DO8和DO16(最大相似系數(shù)始終維持在0.930～0.95)進(jìn)行進(jìn)一步的區(qū)分。因此，我們建議DN4+DN10+DN105+DN39引物組合作為核心引物用于鐵皮石斛遺傳多樣性分析和指紋圖譜的構(gòu)建，尤其可用于建立鐵皮石斛指紋圖譜代碼或指紋圖譜QR編碼[15]。當(dāng)然若是研究不同品種或產(chǎn)地鐵皮石斛的親緣關(guān)系或進(jìn)化關(guān)系，其使用的引物越多，多態(tài)性位點(diǎn)也越多，對物種的親緣關(guān)系(進(jìn)化關(guān)系)的鑒定也就越準(zhǔn)確，因此，若用該核心引物用于鐵皮石斛親緣關(guān)系(進(jìn)化關(guān)系)的鑒定，其結(jié)果將會(huì)不理想。為了更為準(zhǔn)確的表明16份材料彼此間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，使用了全部的20對引物用于聚類分析，結(jié)果表明，外類群—串珠石斛最先被分離出來，與15份鐵皮石斛遺傳距離較遠(yuǎn)。來自浙江蕭山(DO9)、浙江溫嶺雁蕩山(DO10)、浙江富陽(DO14)和浙江臨安(DO15)親緣關(guān)系較近而被聚類在一起，而來自浙江瑞安(DO8)和浙江富陽(DO16)彼此親緣關(guān)系最近而被聚類在一起；來自廣東饒平(DO1)、云南思茅(DO2)和云南紅河(DO11)親緣關(guān)系較近而被聚類在一起。以上來自相同地區(qū)或區(qū)域的基本被聚類在一起。而來自浙江麗水(DO12)、云南文山(DO13)與來自安徽合肥(DO3)、湖南新寧崀山(DO7)和福建武夷山(DO6)的親緣關(guān)系較近而被聚類在一起，由于目前鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)高度商業(yè)化，可能是人為有意、無意攜帶流入這些地區(qū)造成的，亦可能是由于這些種質(zhì)遺傳背景比較復(fù)雜，彼此體內(nèi)流著相同的“血液”，究其原因有待后續(xù)進(jìn)一步研究?？傮w而言，該20對引物聚類結(jié)果能夠比較準(zhǔn)確地反應(yīng)種內(nèi)、種間彼此親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，DN4等16對引物多態(tài)性較高，而DN13、DN23、DN60和DN67多態(tài)性較低。單個(gè)引物均不能將所有供試樣品區(qū)分開來，其中DN4、DN10、DN105、DN81、DN39和DN71區(qū)分率相對較高，利用組合引物能夠?qū)⑺袠悠愤M(jìn)行有效區(qū)分，其中DN4+DN10+DN105+DN39引物組合可作為核心引物予以使用，比較適合用于不同種質(zhì)鐵皮石斛的指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析。最后，利用全部20對引物用于聚類分析，結(jié)果表明，該20對引物可以較好地應(yīng)用于鐵皮石斛種內(nèi)、種間親緣關(guān)系的鑒定。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，引物DN4、DN13、DN39、DN58、DN65、DN67、DN10和DN99可簡單、方便地應(yīng)用于鐵皮石斛與串珠石斛的鑒定。

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Scientific research project of Education Department of Zhejiang Province(Y201533793);School Scientific Research Youth Special Topics of Ningbo City College of Vocational Technology(ZZX15064)

introduction：HU Zhong-Yi(1968—),male,Prof.,Major in the teaching and research of plant foundation and plant genetics.

date:2016-07-04

Evaluation,SelectionandApplicationofDendrobiumofficinaleEST-SSRPrimers

HU Zhong-Yi FU Tao HE Yue-Qiu LI Wen LIN Li

(Ningbo City College of Vocational Technology,Ningbo 315502)

By developing and evaluating EST-SSR primers, we studied their application in genetic diversity, species identification, genetic map construction, genetic relationship identification ofDendrobiumofficinale. The early developed 20 pairs of primers with good polymorphism were used for the analysis of 16 samples(15 samples ofD.officinaleand 1 sample ofD.falconeri) by polyacrylamide gel electrophoresis, and the amplified bands were calculated. Nei’s gene diversity and Simpson index were tested using PopGen32 to analysis the differentiation rate of single primer and combination primers. Finally, the construction of genetic similarity coefficient clustering map was calculated by using NTSYSpc2.1. The 16 pairs of primers, such as DN4, were highly polymorphic, while lower in DN13, DN23, DN60 and DN67. Although single primer could not distinguish all the samples, DN4, DN10, DN105, DN81, DN39 and DN71 displayed relatively higher distinguish rate. All the samples could be distinguished effectively by combined primers, and the DN4+DN10+DN105+DN39 primer set could be used as the core primer for fingerprint construction and genetic diversity analysis ofD.officinale. By cluster analysis, the 20 pairs of primers could be used for the identification of both intraspecific and interspecific phylogenetic relationships ofD.officinale. The primers DN13, DN39, DN4, DN58, DN65, DN67, DN10 and DN99 could be used for the identification ofD.officinaleandD.falconeri. The 20 pairs of primers could be wildly used in the application of genetic diversity analysis, germplasm identification, genetic relationship identification and genetic map construction ofD.officinale.

Dendrobiumofficinale;molecular markers;EST-SSR;primer evaluation;applied research

浙江省教育廳科研項(xiàng)目資助(Y201533793)；寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院校內(nèi)科研青年專項(xiàng)課題(ZZX15064)

胡仲義(1968—)，男，教授，主要從事植物基礎(chǔ)及植物遺傳教學(xué)及科研研究。

2016-07-04

S567.9

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.011