祖奎玲 董樹斌 李建霞 趙蕓玉 趙良成

(北京林業(yè)大學(xué)自然保護(hù)區(qū)學(xué)院，北京 100083)

基于RNA-seq對南蛇藤M(fèi)ADS-box轉(zhuǎn)錄因子序列及表達(dá)分析

祖奎玲 董樹斌 李建霞 趙蕓玉 趙良成*

(北京林業(yè)大學(xué)自然保護(hù)區(qū)學(xué)院，北京 100083)

為了分析南蛇藤M(fèi)ADS-box轉(zhuǎn)錄因子對其雌花發(fā)育和果實(shí)形成的調(diào)控信息，本文基于南蛇藤的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得15個(gè)具有全長開放閱讀框的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子(ColMADS)，并利用生物信息學(xué)方法對其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，基因comp37814_g1和comp41380_g2屬于M-type家族，不含有K盒結(jié)構(gòu)，其他均為MIKC家族；除了comp37713_g1之外，其余均屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白；二級結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋、擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，其中α-螺旋所占比例最高；序列主要包含5種保守基序，基序1和基序2分別含50個(gè)氨基酸且屬于該基因家族的保守基序，僅基序1含有MADS盒。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示南蛇藤ColMADS轉(zhuǎn)錄因子被分為10個(gè)進(jìn)化支，分屬于不同類型的亞家族及不同的組。另外，利用熒光定量PCR檢測方法揭示了這些基因在南蛇藤盛花、落花和幼果不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果表明，2個(gè)基因在盛花期相對表達(dá)值最高，9個(gè)基因在落花期相對表達(dá)值最高，在幼果形成過程中有4個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)。

南蛇藤；MADS-box基因；雌花；序列及表達(dá)分析

南蛇藤(CelastrusorbiculatusThunb.)是衛(wèi)矛科(Celastraceae)南蛇藤屬(Celastrus)落葉木質(zhì)藤本植物，不僅具有重要的藥用價(jià)值，其莖、蔓、葉、花及果實(shí)還具有很好的觀賞價(jià)值，尤其是成熟的果實(shí)，果皮開裂呈現(xiàn)出鮮艷的紅色假種皮結(jié)構(gòu)，在造園上應(yīng)用價(jià)值極高。近年來，國內(nèi)外對南蛇藤的研究主要集中于系統(tǒng)分類[1]、藥用價(jià)值[2]、化學(xué)成分[3]、繁殖生態(tài)學(xué)[4]等方面，而對花和果實(shí)發(fā)育分子機(jī)理的研究仍是空白。

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子是一類能與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用特異性結(jié)合，促使目的基因在特定時(shí)空表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，其名稱來源于釀酒酵母MCM1、擬南芥AGAMOUS、金魚草DEFICIENS和人類的SRF4基因的首字母，這4個(gè)基因編碼的蛋白均有1個(gè)由56～58個(gè)氨基酸組成的高度保守區(qū)的MADS盒[5]。它廣泛存在于動(dòng)物、植物和真菌中，調(diào)控其生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生命過程[6]。在植物中，MADS-box主要參與被子植物花發(fā)育的各個(gè)階段的調(diào)節(jié)過程，在花形態(tài)建成和開花時(shí)間調(diào)節(jié)中發(fā)揮最重要的功能[7]。根據(jù)進(jìn)化特征，MADS-box基因分化為TypeⅠ和TypeⅡ兩類。TypeⅡ基因由MADS(M)、Intervening(I)、Keratin-like(K)和Carboxyl-terminal(C)4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，亦稱MIKC基因，且K結(jié)構(gòu)域僅存在于TypeⅡ中[8]。目前，在植物花發(fā)育的ABCDE模型中，與植物成花相關(guān)的功能基因多數(shù)是TypeⅡ型，主要有AP1、AP3、AG、FLC、SVP和SOC1等，而TypeⅠ基因的功能報(bào)道較少[9]。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，大量植物種類的MADS家族基因已被發(fā)現(xiàn)，不同物種MADS-box基因家族成員的數(shù)量和表達(dá)特性存在較大差異。南蛇藤具有雌雄異株和雄全同株的多性型花發(fā)育特征，其中雌花花期最長且數(shù)量明顯多于兩性花，可決定果實(shí)發(fā)育的數(shù)量[10]，但其發(fā)育的調(diào)控機(jī)理目前尚不清楚。本研究通過分析南蛇藤雌花和果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了39個(gè)unigene序列被注釋為MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，其中15個(gè)序列具有完整的ORF，但其生物信息學(xué)特征和表達(dá)特性仍不清楚。因此，本文對15個(gè)具有完整ORF的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了生物信息學(xué)特性分析，鑒定MADS-box家族基因并對其在南蛇藤不同組織中的表達(dá)情況作了定量分析，旨在為探明南蛇藤雌花發(fā)育和果實(shí)形成的分子機(jī)理提供一定的參考依據(jù)，為下一步MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料來源于北京中國科學(xué)院植物研究所的南蛇藤雌性植株。根據(jù)前期對南蛇藤從花蕾到果實(shí)發(fā)育過程的形態(tài)解剖特征觀察，分別采集同一生長點(diǎn)的南蛇藤盛花、胚珠發(fā)育后凋零的花及幼果，經(jīng)液氮迅速冷凍后放入-80℃冰箱低溫保存用于總RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 南蛇藤M(fèi)ADS-box轉(zhuǎn)錄因子序列來源

基于前期對南蛇藤雌花和果實(shí)的高通量Illumina測序獲取的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(拼接結(jié)果尚未發(fā)表)，對獲取的unigene進(jìn)行比對和功能注釋，使用NCBI在線分析程序ORF Finder(Open Reading Frame Finder,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)查找開放閱讀框,并使用iTAK軟件和在線預(yù)測工具The GENSCAN Web Server(http://argonaute.mit.edu/GENSCAN.html)對獲取的unigene進(jìn)行分析，39個(gè)Unigene序列被注釋為MADS-box轉(zhuǎn)錄因子,但只有15個(gè)序列含有完整的ORF,均含有MADS超家族保守結(jié)構(gòu)域，命名為ColMADS，以此作為后期分析的主要對象。

1.2.2 南蛇藤M(fèi)ADS-box轉(zhuǎn)錄因子序列特征

在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測，并使用在線軟件ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)進(jìn)行氨基酸數(shù)目、相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、分子式、脂肪族氨基酸數(shù)、蛋白質(zhì)疏水性、不穩(wěn)定系數(shù)等的分析。亞細(xì)胞定位使用PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)在線軟件，依據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫對本研究中蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。二級結(jié)構(gòu)特性利用ExPaSy提供的在線程序SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl/page=npsa_sopma.html)預(yù)測分析α螺旋、β折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。保守序列分析利用在線數(shù)據(jù)庫MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)，參數(shù)設(shè)置為:同一基序在1條序列中出現(xiàn)0或1次,基序最大發(fā)現(xiàn)值為5,長度范圍為60個(gè)氨基酸殘基,其他參數(shù)為默認(rèn)值。基序序列特征分析采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件分析。

1.2.3 南蛇藤M(fèi)ADS-box基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

在TAIR(http://www.arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫上下載擬南芥的MADS-box蛋白序列，利用Clustal2.0軟件對所有蛋白和15條南蛇藤轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析，再利用MEGA6.0繪制分子進(jìn)化樹，采用neighbor-joining法則的Poisson Correction模型Bootstrap method值取1 000。

1.2.4 RNA提取及Real-time RT-PCR分析

采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根)進(jìn)行總RNA提取,利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，USA)和Agilent 2100 Bioanalyzer測定濃度及OD260/OD280，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

利用PrimerScript RT reagent Kit(TaKaRa，Japan)將待測RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA，0.5 μg；50 μmol·L-1oligo dT，0.5 μL；100 μmol·L-1random 6 mers，0.5 μL；5×PrimerScript Buffer，2 μL；Primer Script RT Enzyme Mix I，0.5 μL；Nuclease-free H2O，加至10 μL。反應(yīng)程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s。逆轉(zhuǎn)錄完畢后加入90 μL Nuclease-free H2O儲存在-20℃冰箱備用。引物采用Roche LCPDS2軟件設(shè)計(jì)并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，內(nèi)參基因選用18 S，序列見表1。

表1 Real-time RT-PCR引物序列

Real-time RT-PCR反應(yīng)體系：2×LightCycler? 480 SYBR Green I Master，5 μL；10 μmol·L-1Forward primer，0.2 μL；10 μmol·L-1Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR程序：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，設(shè)置3次重復(fù)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性：從60℃緩慢升溫至97℃，每1℃采集5次熒光信號。反應(yīng)在LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)上完成。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt算法進(jìn)行分析計(jì)算[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1南蛇藤M(fèi)ADS-box轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析

通過對南蛇藤雌花和果實(shí)高通量Illumina測序獲取的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)39個(gè)Unigene序列被注釋為MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，其中15個(gè)序列含有完整的ORF。將15個(gè)MADS-box氨基酸序列在PlantTFDB數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果表明，comp37814_g1和comp41380_g2屬于M-type家族,不含有K盒結(jié)構(gòu),其他均為MIKC家族,同時(shí)獲得同源性最高的擬南芥氨基酸序列，其中9個(gè)轉(zhuǎn)錄因子屬于K-box和MADS-box特征家族蛋白(表2)。

對氨基酸數(shù)目、相對分子質(zhì)量的分析表明，南蛇藤M(fèi)ADS-box的氨基酸序列數(shù)量均在200～275，對應(yīng)的分子量在22 911.4～31 531.9。等電點(diǎn)分析表明，comp37814_g1、comp33345_g1、comp43219_g1、comp40128_g2、comp6895_g1呈酸性，其他的呈堿性(comp39346_g1接近中性)。從不穩(wěn)定指數(shù)來看，comp37713_g1指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其他為不穩(wěn)定蛋白。15個(gè)MADS-box的氨基酸的脂溶指數(shù)均小于100，為親水性蛋白(表3)。南蛇藤M(fèi)ADS-box蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋、擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。其中，α-螺旋所占比例最高，其次是無規(guī)則卷曲。亞細(xì)胞定位分析表明，comp24959_g2和comp34522_g1定位到細(xì)胞質(zhì)上的概率較高，comp43365_g3定位到質(zhì)膜上的概率較高，其他蛋白質(zhì)都定位到細(xì)胞核上(表4)。

2.2 南蛇藤M(fèi)ADS-box氨基酸序列保守基序分析

對南蛇藤M(fèi)ADS-box氨基酸序列的保守基序分析結(jié)果表明：基序1和基序2含50個(gè)氨基酸,在所有MADS-box序列中均含有。對應(yīng)最佳匹配序列分別是MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGL-LKKAYELSVLCDAEVALIVFST和EVNKLKAKYE-NLQRTQRHLLGEDLGPLSVKELQNLEKQLEAALVL-TRQRK(圖1)。除comp41380_g2外，基序3在所有MADS-box序列中均含有，基序3的最佳匹配序列是RGKLYEFCSSSS。基序4含有31個(gè)氨基酸，僅次于基序1和基序2，其最佳匹配序列為TQYMLDQFSDLQNKEHMLMESNKALTMKLEE，但在comp39346_g1、comp37713_g1、comp33345_g1、comp37814_g1和comp41380_g2序列中不包含基序4?；?含有的氨基酸數(shù)量最少，其最佳匹配序列為CLERYQKCSYS(圖2)，在comp37713_g1、comp33345_g1、comp37814_g1和comp41380_g2序列中不包含基序5。利用SMART在線工具對5個(gè)基序命名，只有基序1(number:SM00432)為MADS盒，屬于SRP-TF結(jié)構(gòu)域，其他序列命名未知。

表2 南蛇藤M(fèi)ADS-box轉(zhuǎn)錄因子在PlantTFDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測信息

表3MADS-box基因家族氨基酸成員的基本信息

Table3ThebasicinformationofC.orbiculatusMADS-boxgenefamily

Unigene編號UnigeneID氨基酸數(shù)量Numberofaminoacids(aa)分子量Molecularweight(Da)等電點(diǎn)TheoreticalpI不穩(wěn)定指數(shù)Instabilityindex脂溶指數(shù)Aliphaticindexcomp37814_g124627879.85.4649.0988.82comp33345_g120022911.45.0157.9664.09comp40042_g123026345.98.7945.383.13comp43219_g124627888.56.4854.8286.75comp41380_g227531531.99.6860.8964.22comp40805_g124728327.19.4458.8775.47comp24959_g224528441.48.9153.8687.18comp34522_g124628313.18.4943.1375.33comp18144_g124828215.29.1741.8381.37comp40128_g223025938.36.1854.7883.09comp37381_g122325800.49.5345.683.99comp43365_g3217251589.259.4482.26comp37713_g123026680.29.3133.1675.43comp6895_g1240281316.7655.4382.08comp39346_g120924426.87.0268.8280.67

表4南蛇藤M(fèi)ADS-box蛋白家族二級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位

Table4ThesecondarystructureandsubcellularlocationofC.orbiculatusMADS-boxgenefamily

名稱NameNR編號NRIDα-螺旋(個(gè))Alphahelix擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)(個(gè))Extendedstrandβ-轉(zhuǎn)角(個(gè))Betaturn無規(guī)則卷曲(個(gè))Randomcoil亞細(xì)胞定位Subcellularlocalizationcomp37814_g1XP_007043361.1109491672細(xì)胞核Cellnuclearcomp33345_g1KCW61921.189241473細(xì)胞核Cellnuclearcomp40042_g1KDP43607.1128311160細(xì)胞核Cellnuclearcomp43219_g1XP_007043947.1121461564細(xì)胞核Cellnuclearcomp41380_g2XP_006382260.11163416109細(xì)胞核Cellnuclearcomp40805_g1XP_007025250.1124381075細(xì)胞核Cellnuclearcomp24959_g2XP_007037634.1128392652細(xì)胞質(zhì)Cytoplasmcomp34522_g1ACD39982.1139272159細(xì)胞質(zhì)Cytoplasmcomp18144_g1XP_007051983.1119362271細(xì)胞核Cellnuclearcomp40128_g2CDP01559.1119342453細(xì)胞核Cellnuclearcomp37381_g1XP_007020163.1134292436細(xì)胞核Cellnuclearcomp43365_g3XP_007051978.1138251143質(zhì)膜Membranecomp37713_g1NP_001267937.1101522948細(xì)胞核Cellnuclearcomp6895_g1XP_007043265.1118351572細(xì)胞核Cellnuclearcomp39346_g1ADX86812.194423043細(xì)胞核Cellnuclear

圖1 南蛇藤M(fèi)ADS-box保守基序Fig.1 Conserved motifs identified from MADS-box genes in C.orbiculatus

圖2 南蛇藤M(fèi)ADS-box基因保守元件分布圖Fig.2 Distribution of the identified motifs in MADS-box genes in C.orbiculatus

2.3 MADS-box家族基因保守結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)進(jìn)化分析

為揭示MADS-box基因家族間的進(jìn)化關(guān)系，采用鄰接法對15個(gè)南蛇藤和擬南芥MADS-box保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果如圖3所示，南蛇藤15個(gè)MADS-box被分為10個(gè)進(jìn)化支(兩個(gè)為未知亞組)，分屬于不同類型的亞家族及不同的組。其中，comp40042_g1、comp34522_g1和comp18144_g1屬于SEP亞組，comp33345_g1屬于FLC亞組，comp43365_g3屬于SOC1亞組，comp43219_g1屬于AGL亞組，comp37713_g1、comp39346_g1、comp40805_g1和comp37381_g1屬于AG亞組，comp37814_g1和comp6895_g1分別屬于TT16和MADS57兩個(gè)亞組，這兩個(gè)家族包含的擬南芥氨基酸數(shù)目較少，comp41380_g2屬于AGL80亞組，較其他氨基酸相對獨(dú)立。

從基因的進(jìn)化樹分析表明，F(xiàn)BP2和SEP2進(jìn)化關(guān)系最近，且與AGL6有較近的進(jìn)化關(guān)系，均屬于SEP家族，為控制花形態(tài)建成的同源異型基因；AGL8與前三個(gè)基因在同一個(gè)大的進(jìn)化支上；FLC與SOC1分屬于兩個(gè)相鄰的進(jìn)化分支；AGL15與JOINTLESS進(jìn)化關(guān)系接近；AG1、AGL11、PMADS和PMADS2這4個(gè)基因的進(jìn)化關(guān)系接近，MADS57和AGL80分別獨(dú)立分支且AGL80與南蛇藤其他MADS-box基因進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

圖3 南蛇藤和擬南芥的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of MADS-box conserved domain from C.orbiculatus and Arabidopsis

2.4 南蛇藤M(fèi)ADS-box基因組織表達(dá)分析

通過Real-time RT-PCR分析MADS-box基因在南蛇藤不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示，這15個(gè)MADS-box基因在南蛇藤雌花發(fā)育和果實(shí)形成過程中均有不同程度的表達(dá)。其中，MADS57、FLC、FBP2、AGL8、AG1、AGL15、SEP2、SOC1和JOINLESS在落花期相對表達(dá)量最高，而在幼果期SEP2、SOC1和JOINLESS相對表達(dá)量最低，推測這些基因可能參與南蛇藤花器官的凋亡和幼胚的形成；PMADS和PMADS2在盛花期相對表達(dá)量最高，隨著果實(shí)發(fā)育，其表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯下降趨勢，在幼果期表達(dá)量極低，說明這2個(gè)基因主要參與南蛇藤雌花的發(fā)育過程；而AGL6、AGL80、AGL11和TESTA16的相對表達(dá)值在幼果期卻明顯上升至最高峰，表明這4個(gè)基因?qū)δ仙咛俟麑?shí)發(fā)育起促進(jìn)作用。

圖4 南蛇藤M(fèi)ADS-box基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)分析 CO1.盛開的雌花；CO2.落花；CO3.幼果Fig.4 The expression analysis of MADS-box genes of C.orbiculatus in different development periods CO1. Full blooming； CO2. Flower senescence；CO3. Young fruit

3 討論

南蛇藤生長適應(yīng)性強(qiáng)，在園林綠化、藥用等方面均具有重要的價(jià)值[12]。然而，其雌雄異株且少量雄全同株的性別多樣性特征導(dǎo)致結(jié)實(shí)率不穩(wěn)定，制約了該植物資源的開發(fā)和利用。目前南蛇藤基因組背景信息非常缺乏，本文首次通過分析其雌花和果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得了15個(gè)具有完整ORF的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，并對其氨基酸基本信息、亞細(xì)胞定位、氨基酸結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域特征、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及其在花和果實(shí)中的表達(dá)情況做了定量分析，不僅豐富了植物MADS-box基因家族信息，也為南蛇藤雌花發(fā)育和果實(shí)形成的調(diào)控機(jī)理研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，對該植物資源的開發(fā)和利用具有促進(jìn)作用。

MADS-box基因家族廣泛存在于高等植物中，對花器官分化、開花時(shí)間的調(diào)節(jié)及果實(shí)發(fā)育與成熟等方面起關(guān)鍵調(diào)控作用[13]。目前許多植物的MADS-box家族基因在不同層面上已被研究，結(jié)果表明不同物種MADS-box基因家族成員的數(shù)量和表達(dá)特性存在較大差異。在MADS-box家族基因的兩種結(jié)構(gòu)類型中，大量的研究集中于MIKC型基因。植物MIKC型基因可以分為13個(gè)亞家族，而擬南芥基因組中含有12個(gè)亞家族[14～15]。本研究基于南蛇藤的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出13個(gè)MIKC型基因和2個(gè)M-type型基因，它們分屬于10個(gè)不同的進(jìn)化支，這些基因可能通過相互作用來調(diào)控南蛇藤雌花的發(fā)育和果實(shí)的形成。

被子植物的花器官發(fā)育取決于不同發(fā)育階段調(diào)控基因特定的時(shí)空表達(dá)和相互作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)一些參與花形態(tài)建成ABCDE模型中的關(guān)鍵基因(如AGL8、AG1、AGL15、SEP2)與調(diào)控開花時(shí)間的基因(如FLC和SOC1)在南蛇藤落花期相對表達(dá)量最高，說明這些基因可能協(xié)同作用于南蛇藤花器官凋亡及幼胚形成過程。AGL8基因，又稱為FRUITFULL(FUL)，屬于ABCDE模型中的A類基因，在花發(fā)育整個(gè)時(shí)期的不同組織中均有表達(dá)[17]。在南蛇藤盛花和落花階段，AGL8基因均有顯著表達(dá)，說明該基因在南蛇藤雌花發(fā)育中起著主要正向調(diào)控作用。在植物開花時(shí)間的調(diào)控研究中，F(xiàn)LC基因是首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的控制開花時(shí)間基因[18]，后來研究發(fā)現(xiàn)，低溫能夠促進(jìn)FLC基因的表達(dá)，而FLC通過抑制SOC1的表達(dá)來抑制成花[19]。FLC和SOC1在調(diào)控開花時(shí)間過程中，兩者相互作用并且能被外在環(huán)境和自身內(nèi)源信號所誘導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LC和SOC1在南蛇藤M(fèi)ADS-box基因家族中占有重要位置，在進(jìn)化樹是源自同一分支，并且在南蛇藤雌花發(fā)育整個(gè)過程中顯著表達(dá)，兩者均是在花器官脫落、幼胚發(fā)育時(shí)期具有最高的相對表達(dá)量。由此可見，花器官形態(tài)建成和開花時(shí)間的調(diào)節(jié)是相互關(guān)聯(lián)的調(diào)控的過程，這些基因參與花發(fā)育的各個(gè)階段的調(diào)節(jié)并且相互作用。南蛇藤開花時(shí)間相關(guān)基因的調(diào)控過程有待下一步通過同源克隆等方法探究其功能。

在果實(shí)發(fā)育階段，AG類基因和E類基因發(fā)揮重要調(diào)控作用[20]。模式植物擬南芥中，已經(jīng)成功分離出FBP7、FBP11、STK、SHP和SEP等與胚珠發(fā)育密切相關(guān)的基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)SHP1和SHP2在心皮壁與胚座框之間的邊界區(qū)表達(dá)，調(diào)控邊界區(qū)分裂層的分化以及木質(zhì)化層的木質(zhì)化[21]。在番茄果實(shí)發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，與擬南芥SHP同源的AGAMOUS-LIKE1(TAGL1)基因在果實(shí)發(fā)育早期及成熟期均顯著表達(dá)[22]。但在本研究中并未發(fā)現(xiàn)SHP及其同源基因?qū)δ仙咛俟麑?shí)發(fā)育的特異性表達(dá)調(diào)控。SEP類基因在植物發(fā)育中研究較深入并且其功能多樣，在水稻中，SEP類基因調(diào)控花器官的發(fā)育和小穗形態(tài)特征等[23]；在草莓中，SEP類基因?qū)ㄆ鞴侔l(fā)育及果實(shí)成熟起重要的調(diào)控作用[24]。本研究中，SEP2基因在落花期顯著表達(dá)，并隨著果實(shí)的發(fā)育其表達(dá)量呈下降趨勢，推測該基因?qū)ε咧榈陌l(fā)育起顯著促進(jìn)作用，但對果實(shí)成熟的調(diào)節(jié)下調(diào)表達(dá)。AGL6為SEP類的姐妹類群，但其在功能上不同于SEP類基因。例如，在擬南芥中，AGL6基因在苞葉、四輪花器官和胚珠的原基中僅在近軸一側(cè)表達(dá)，并通過限制開花抑制因子FLC和MAF的表達(dá)來促進(jìn)開花的提前[26]。本研究中，AGL6基因的相對表達(dá)值在盛花期和落花期較低，而幼果期最高，推測AGL6不僅與南蛇藤果實(shí)發(fā)育有關(guān)，也通過與雌花發(fā)育相關(guān)基因的相互作用促進(jìn)開花及花器官的形成，但需要進(jìn)一步深入對其功能進(jìn)行研究。

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This work was supported by funding from the National Natural Science Foundation of China(31370213)；Beijing Natural Science Foundation(5133036)

introduction：ZU Kui-Ling(1991—),female,Master,mainly engaged in molecular biology of plant development.

date:2016-07-06

SequenceandExpressionAnalysisofMADS-boxGenesinCelastrusorbiculatusThunb.BasedonRNA-seqData

ZU Kui-Ling DONG Shu-Bin LI Jian-Xia ZHAO Yun-Yu ZHAO Liang-Cheng*

(School of Nature Reservation,Beijing Forestry University,Beijing 100083)

For the regulatory information of MADS-box genes on the flower and fruit development inCelastrusorbiculatusThunb, 15 MADS-box genes(ColMADS) with full ORF(Open Reading Frame)were identified from transcriptome generated from female flower and fruit. The features of the proteins were analyzed by the bioinformatics methods. The comp37814_g1and comp41380_g2 belonged to M-type family, while other 13 genes were the members of MIKC. All were unstable hydrophilic proteins except for comp37814_g1. Alpha helix, beta turn, extended strand and random coil were found from the secondary structure ofColMADSprotein, and alpha helix was major part. Five motifs were identified. The Motif 1 and Motif 2, both consisting of 50 amino acids, were the conserved structure of MADS-box family and only Motif 1 contained MADS domain. By phylogenetic analysis, 15ColMADSgenes were divided into 10 clades, belonging to different subfamilies and groups. In addition, the expression patterns of the genes among different development stages were analyzed using real-time RT-PCR. Two genes were highly expressed at flower blooming stage and nine genes were obviously expressed at flower senescence stage. There are four genes upregulated during the young fruit development.

CelastrusorbiculatusThunb.;MADS-box genes;female flower;sequence and expression analysis

國家自然科學(xué)基金(31370213)；北京市自然科學(xué)基金(5133036)

祖奎玲(1991—)，女，碩士研究生，主要研究方向是植物發(fā)育分子生物學(xué)。

* 通信作者：E-mail:lczhao@bjfu.edu.cn

2016-07-06

* Corresponding author：E-mail:lczhao@bjfu.edu.cn

Q949.754.7

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.010