馮德明 溫佩穎 趙 暢 楊遠(yuǎn)彪 楊桂燕 于麗麗 高彩球*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)帽兒山教學(xué)區(qū)，尚志 150040)

剛毛檉柳ThDREB基因在酵母中的表達(dá)及抗逆能力分析

馮德明1溫佩穎1趙 暢1楊遠(yuǎn)彪2楊桂燕1于麗麗1高彩球1*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)帽兒山教學(xué)區(qū)，尚志 150040)

DREB蛋白能特異地與DRE(dehydration responsive element)順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)控下游多個(gè)與逆境相關(guān)基因的表達(dá)，在植物對(duì)多種逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用。為了研究剛毛檉柳ThDREB基因是否具有抗逆功能，將ThDREB基因插入到酵母表達(dá)載體pYES2中構(gòu)建成重組載體，轉(zhuǎn)入釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中獲得重組型酵母。分別比較轉(zhuǎn)ThDREB基因酵母和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照酵母在山梨醇、H2O2、CdCl2、NaCl、Na2CO3、MgCl2、-20℃脅迫處理之后的存活能力。結(jié)果顯示，ThDREB基因能有效提高轉(zhuǎn)基因酵母的抗干旱、鹽、堿、氧化、重金屬及低溫脅迫的能力，表明ThDREB基因可能參與了檉柳多種抗逆調(diào)控過程。

剛毛檉柳；DREB轉(zhuǎn)錄因子；酵母表達(dá)；非生物逆境抗性

在基因工程育種中，由于調(diào)控基因可以激活或抑制多個(gè)與抗逆相關(guān)功能基因的表達(dá)，因此，與轉(zhuǎn)入單個(gè)功能基因相比，轉(zhuǎn)入調(diào)控基因可能對(duì)植物抗逆能力的提高改良效果更好。轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控主要是通過轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式元件發(fā)生特異性相互作用來調(diào)控基因的表達(dá)。因此，轉(zhuǎn)錄因子得到了人們廣泛的關(guān)注。

DREB(dehydration responsive element binding protein)轉(zhuǎn)錄因子是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族成員。很多研究證明，DREB類轉(zhuǎn)錄因子在逆境抗性中起重要作用，轉(zhuǎn)DREB基因植物抗逆能力明顯提高。如Peng等[1]從紅樹(Avicenniamarina)中克隆獲得了CBF/DREB1同源基因AmCBF2，發(fā)現(xiàn)AmCBF2的表達(dá)受冷、干旱、高鹽、重金屬和脫落酸(ABA)脅迫誘導(dǎo)，表明AmCBF2可能參與冷、干旱和重金屬脅迫響應(yīng)。Xiong和Fei[2]將多年生黑麥草(LoliumperenneL.)DREB基因(LpCBF3)轉(zhuǎn)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗凍能力明顯提高，而且轉(zhuǎn)基因擬南芥中，過量表達(dá)的LpCBF3能誘導(dǎo)擬南芥DREB1A/CBF3的目標(biāo)基因COR基因，COR15a和RD29A的表達(dá)，在黑麥草的遠(yuǎn)源植物擬南芥中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子功能。綠豆(Vignaradiata)VrDREB2A基因的表達(dá)受干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)，過表達(dá)VrDREB2A基因擬南芥能通過激活下游一些基因的表達(dá)增加干旱和高鹽脅迫耐受性[3]。蕎麥(Fagopyrumesculentum)FeDREB1基因能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的冷凍和干旱脅迫耐性[4]。

剛毛檉柳(Tamarixhispida)是一種灌木或小喬木，具有很強(qiáng)的抗旱、耐鹽、耐水濕、抗沙埋能力，是優(yōu)良的防風(fēng)固沙、水土保持和鹽堿地造林樹種[5]。同時(shí)，剛毛檉柳也是研究植物抗旱耐鹽機(jī)制和克隆抗逆基因的理想樹種。因此，本研究從剛毛檉柳cDNA文庫中克隆到ThDREB基因，將其構(gòu)建到pYES2中，轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，并以轉(zhuǎn)pYES2空載體酵母做對(duì)照，比較轉(zhuǎn)基因酵母和對(duì)照酵母的抗逆能力。結(jié)果顯示，與對(duì)照酵母相比，轉(zhuǎn)ThDREB基因酵母明顯提高了抗旱、耐鹽和耐重金屬等脅迫的能力。ThDREB基因可能是一個(gè)優(yōu)良的抗逆基因，為進(jìn)一步通過基因工程手段應(yīng)用于植物抗逆轉(zhuǎn)基因育種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1酵母表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)ThDREB基因全長序列和pYES2載體特征設(shè)計(jì)ThDREB基因酵母表達(dá)載體引物，上游引物為ATCGAAGCTTAGCATGGCCTTGTACTATGGCTATC(下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn)序列)；下游引物為CGATGGATCCTCAAATAGAATGGCTCCACAATG(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)序列)。以兩個(gè)月生剛毛檉柳根部cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得含有酶切位點(diǎn)的ThDREB基因序列，經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ酶酶切純化回收后與同樣經(jīng)過HindⅢ和BamHⅠ酶雙酶切的酵母表達(dá)載體pYES2連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證后，獲得重組載體pYES2-ThDREB。根據(jù)pYES2載體試劑盒說明(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pYES2-ThDREB轉(zhuǎn)化到酵母株系INVSC1(His-，Leu-，Trp-和Ura-)。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化的酵母單菌落(含重組質(zhì)粒pYES2-ThDREB)擴(kuò)大培養(yǎng)，分別提取重組酵母DNA和經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)0、24、36和48 h后的RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用ThDREB基因引物進(jìn)行PCR和RT-PCR擴(kuò)增，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。保存具有目的條帶的酵母菌株，標(biāo)記為INVSC1(pYES2-ThDREB)。同時(shí)將空pYES2載體轉(zhuǎn)入INVSC1，作為陰性對(duì)照，標(biāo)記為INVSC1(pYES2)。

1.2 酵母脅迫處理

挑取INVSC1(pYES2)和INVSC1(pYES2-ThDREB)單克隆酵母細(xì)胞在SC-Ura液體培養(yǎng)基(含有2%葡萄糖)中，30℃，180 r·min-1震蕩培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體，用含有2%半乳糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)調(diào)整OD600=0.4，30℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h。測(cè)量OD600，使INVSC1(pYES2)和INVSC1(pYES2-ThDREB)OD600相等，分別離心收集菌體用于脅迫處理。

對(duì)收集的INVSC1(pYES2)和INVSC1(pYES2-ThDREB)菌體分別用5 mol·L-1NaCl處理24 h，2 mol·L-1山梨醇脅迫24 h，-20℃、6% Na2CO3、1% MgCl2、1 mmol·L-1H2O2、1% CdCl2各脅迫處理1 h。將處理后的菌液作10×稀釋(分別稀釋100，102，103，104，105倍)，取2 μL點(diǎn)在含有2%葡萄糖的SC-Ura固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h后觀察酵母生長情況。

此外，將收集的INVSC1(pYES2)和INVSC1(pYES2-ThDREB)菌體分別置于5 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中脅迫處理，脅迫包括1、2、3、4和5 mol·L-1的NaCl；0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mol·L-1的山梨醇；1.2%、2.4%、3.6%、4.8%、6.0%的Na2CO3；0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的CdCl2和MgCl2；0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol·L-1的H2O2。30℃條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h后測(cè)定細(xì)胞密度。低溫脅迫(-20℃)時(shí)，分別對(duì)接種于5 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的菌體脅迫3、6、9、12或24 h后，在30℃條件下恢復(fù)生長9 h(搖床震蕩培養(yǎng))后再測(cè)定細(xì)胞密度(OD600)。同時(shí)對(duì)接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的兩種酵母進(jìn)行非脅迫處理，30℃震蕩培養(yǎng)8、9、10、11和12 h后，測(cè)定OD600值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS軟件包(SPSS,Chicago,Illinois,USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1ThDREB基因酵母表達(dá)載體及酵母重組子的獲得

通過雙酶切、連接將ThDREB基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，隨機(jī)挑取3個(gè)大腸桿菌單菌落(含pYES2-ThDREB)，搖菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果所示，擴(kuò)增得到了783 bp的特異條帶，初步證明目的基因已經(jīng)成功整合至載體pYES2中(圖1A)。

用HindⅢ和BamHⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)上述PCR檢測(cè)為陽性的重組質(zhì)粒(pYES2-ThDREB)進(jìn)行雙酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示雙酶切后的兩個(gè)片段與目的基因和載體片段大小一致，表明目的基因已正確連接至pYES2載體，成功構(gòu)建了ThDREB基因酵母表達(dá)載體(圖1B)。

隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化的酵母單菌落(含重組質(zhì)粒pYES2-ThDREB)擴(kuò)大培養(yǎng)，提取酵母DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段與目的基因長度一致，表明重組質(zhì)粒(pYES2-ThDREB)已經(jīng)轉(zhuǎn)入酵母INVSc1，成功的獲得了酵母重組子INVSC1(pYES2-ThDREB)(圖1C)。

圖1 重組質(zhì)粒(pYES2-ThDREB)檢測(cè)和重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)鑒定 A.重組質(zhì)粒pYES2-ThDREB PCR電泳圖譜；B.重組質(zhì)粒pYES2-ThDREB雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜；C.重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)PCR產(chǎn)物電泳圖譜；D.重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜 M. DNA marker DL2000Fig.1 Identification of recombined plasmid and recombinant INVSc1 A. Electrophoresis of recombinant plasmid pYES2-ThDREB PCR; B. Electrophoresis of recombinant plasmid pYES2-ThDREB double enzyme digestion products; C. Electrophoresis of recombinant yeast INVSC1(pYES2-ThDREB) PCR products; D. Electrophoresis of recombinant yeast INVSC1(pYES2-ThDREB) RT-PCR products M. DNA Marker DL2000

進(jìn)一步利用RT-PCR分析了重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)24、36和48 h后外源基因ThDREB的表達(dá)情況。結(jié)果表明，經(jīng)2%半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)后，外源基因ThDREB成功表達(dá)，且誘導(dǎo)24 h后ThDREB基因的表達(dá)水平較高，因此重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)可以用于后續(xù)的脅迫實(shí)驗(yàn)，且誘導(dǎo)時(shí)間為24 h。

2.2逆境脅迫下重組酵母INVSc1(pYES2-ThDREB)生長比較

為研究ThDREB基因的抗逆功能，將重組酵母菌和對(duì)照酵母菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行非生物逆境脅迫實(shí)驗(yàn)(圖2)。結(jié)果顯示，非脅迫條件下，重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)和對(duì)照酵母INVSC1(pYES2)的生長狀況基本一致，表明ThDREB基因的轉(zhuǎn)入對(duì)酵母生長無明顯影響，兩種酵母的脅迫初始濃度及生長速度一致(圖2A)。而在脅迫條件下，兩種酵母的生長明顯不一致。具體的說，在鹽脅迫(NaCl和MgCl2)和鹽堿脅迫(Na2CO3)條件下，重組酵母的生長明顯優(yōu)于對(duì)照酵母，并且隨著稀釋倍數(shù)擴(kuò)大，二者的差異也更加顯著(圖2)，表明ThDREB基因的表達(dá)明顯增強(qiáng)酵母細(xì)胞的耐鹽和鹽堿脅迫的能力(圖2)。而在山梨醇脅迫、H2O2脅迫、重金屬CdCl2脅迫和冷脅迫(-20℃)下，轉(zhuǎn)基因酵母的存活率也明顯高于對(duì)照酵母，尤其是稀釋105倍時(shí)，對(duì)照酵母無一存活，而重組酵母仍有相對(duì)較高的存活率(圖2)；表明ThDREB基因的表達(dá)除了提高轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞的耐鹽、堿能力外，還能明顯提高轉(zhuǎn)基因酵母的抗旱、耐重金屬、氧化以及抗低溫脅迫等能力，ThDREB基因的表達(dá)提高了重組酵母細(xì)胞的多重抗逆能力。

圖2 重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)和對(duì)照酵母INVSC1(pYES2)在不同脅迫條件下生長狀況對(duì)比Fig.2 The compared of growth between INVSC1(pYES2-ThDREB) and INVSC1(pYES2) under different treatments

圖3 不同脅迫下重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)和對(duì)照酵母INVSC1(pYES2)OD600值比較Fig.3 The compared of growth activity(OD600 ) beween of INVSC1(pYES2-ThDREB) and INVSC1(pYES2) under different treatments

2.3逆境脅迫下重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)成活率比較

為了進(jìn)一步的定量比較重組酵母和對(duì)照酵母在逆境脅迫下的生長情況，測(cè)定了不同濃度或不同脅迫時(shí)間后的重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)和對(duì)照酵母INVSC1(pYES2)的OD600值(圖3)。結(jié)果同圖2，在非脅迫條件下，各時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照酵母和重組酵母OD600值無顯著差異，而兩種酵母在實(shí)驗(yàn)所選的幾種脅迫(NaCl、MgCl2、山梨醇、CdCl2、NaCO3、H2O2、-20℃)處理后，隨著脅迫濃度的增加或脅迫時(shí)間的延長OD600值都逐漸減小，但在同一脅迫濃度或脅迫時(shí)間，重組酵母的INVSC1(pYES2-ThDREB)的OD600值明顯高于對(duì)照酵母INVSC1(pYES2)的OD600值，且在大部分脅迫時(shí)間點(diǎn)或脅迫濃度差異達(dá)到顯著水平(P<0.05，圖中*表示)。表明重組酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)對(duì)各種逆境脅迫的抗性明顯高于對(duì)照酵母，ThDREB基因能提高重組酵母的多重抗逆能力。

3 討論

DREB蛋白能特異地與DRE(dehydration responsive element)順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)控下游多個(gè)與逆境相關(guān)基因的表達(dá)。因此，DREB類轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)多種逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用。如李墨野等[6]對(duì)干旱脅迫下轉(zhuǎn)LbDREB基因和對(duì)照大青楊生長量、保護(hù)酶、丙二醛含量、脯氨酸含量及相對(duì)電導(dǎo)率等進(jìn)行測(cè)定，證實(shí)LbDREB基因提高了轉(zhuǎn)基因大青楊的抗旱能力。側(cè)金盞花(Adonisamurensis)AaDREB1基因能特異的結(jié)合DRE/CRT元件，其表達(dá)受鹽、干旱、冷和脫落酸的誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)AaDREB1基因擬南芥和水稻明顯增強(qiáng)了鹽、干旱和低溫脅迫耐受性[7]。Liu等[8]從桑樹中克隆獲得了一個(gè)A4亞家族DREB基因(MnDREB4a)。熱、冷、干旱、鹽脅迫下，MnDREB4a基因啟動(dòng)子能直接啟動(dòng)下游的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因的表達(dá)，且脅迫12 h后GUS染色變深。過表達(dá)MnDREB4a基因煙草明顯提高了熱、冷、干旱和鹽脅迫耐受性。

酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種快速地了解基因脅迫響應(yīng)功能的有效系統(tǒng)。如Yang等[9]通過將檉柳金屬硫蛋白ThMT3轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞證實(shí)該基因提高了Cd2+、Zn2+、Cu2+和NaCl脅迫耐受性。Zhou等[10]也在酵母中研究了日本鳶尾液泡膜H+-ATPase C亞基基因的功能。Gao等[11]通過比較逆境脅迫后轉(zhuǎn)基因和對(duì)照酵母的存活率證實(shí)ThVHAc1基因能提高山梨醇、冷、NaCl、Na2CO3、MgCl2、H2O2和CdCl2等脅迫耐受性。進(jìn)一步，Yang等[12]證實(shí)ThVHAc1基因明顯提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥和檉柳CdCl2脅迫耐受性。Li等[13]從齒肋赤蘚(SyntrichiacaninervisMitt)中克隆獲得了10個(gè)A-5DREB亞家族基因(ScDREB1～10基因)，其中6個(gè)ScDREB基因(ScDREB1、ScDREB2、ScDREB4、ScDREB6、ScDREB7和ScDREB8)參與ABA依賴的信號(hào)通路和干旱、鹽、冷脅迫響應(yīng)。ScDREB3也對(duì)干旱、鹽和冷脅迫應(yīng)答，但對(duì)ABA不敏感。而ScDREB5基因參與了非ABA依賴的冷脅迫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ScDREB9和ScDREB10對(duì)各脅迫因子或ABA處理略有或無應(yīng)答。其中的4個(gè)ScDREB基因轉(zhuǎn)入酵母結(jié)果表明，ScDREB3和ScDREB5提高了酵母的耐鹽和冷脅迫能力。ScDREB8和ScDREB10提高了轉(zhuǎn)基因酵母的滲透、鹽、冷和高溫脅迫等多重耐受性，尤其是提高了滲透脅迫和鹽脅迫耐受性。同樣，本研究中轉(zhuǎn)ThDREB基因酵母系統(tǒng)初步證實(shí)檉柳ThDREB基因能提高酵母多重抗逆性，因此我們推測(cè)ThDREB基因可能具有多種抗性。在后續(xù)研究中，我們將ThDREB基因轉(zhuǎn)入植物中，分析轉(zhuǎn)基因植物的抗逆能力，并進(jìn)一步對(duì)該基因的上游調(diào)控機(jī)制、對(duì)下游基因的表達(dá)調(diào)控等方面進(jìn)行研究，以了解ThDREB基因的抗逆調(diào)控機(jī)制。

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National-level College Students’ Innovative Entrepreneurial Training Plan Program(20151022507) and the Scientific Research Fund of Heilongjiang Provincial Education Department(No.12523017).

introduction：FENG De-Ming(1995—),female,undergraduate,mainly engaged in the study of forest tree genetic and breeding.

date:2016-06-21

ExpressionandStressToleranceCharaterizationofaThDREBGenefromTamarixhispidainYeast

FENG De-Ming1WEN Pei-Ying1ZHAO Chang1YANG Yuan-Biao2YANG Gui-Yan1YU Li-Li1GAO Cai-Qiu1*

(1.Northeast Forestry University,State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Harbin 150040；2.The Maoershan Teaching Area of Northeast Forestry University,Shangzhi 150040)

DREB protein could specifically bind to DRE(dehydration responsive element) cis-acting elements, and regulate the expression of downstream stress related gene. It plays an important role in the regulation responses of plants to abiotic stress. To explore the abiotic stress tolerance role ofDREB(ThDREB) fromTamarixhispida, the recombinant plasmid(named aspYES2-ThDREB) was constructed by inserting theThDREBgene into the yeast expression vector pYES2. The plasmidpYES2-ThDREBwas transformed into the yeastSaccharomycescerevisiae, and the yeast transformed with empty pYES2 was used as the control. ThepYES2-ThDREBandpYES2 recombinant yeast were treated with sorbitol, H2O2, CdCl2, NaCl, Na2CO3, MgCl2, and -20℃, respectively. ThepYES2-ThDREBrecombinant yeast was tolerant to all above abiotic treatments, suggesting thatThDREBmaybe an important stress-regulating genes inT.hispida.

Tamarixhispida;DREB;yeast expression;abiotic stress tolerance

大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510225071)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12523017)

馮德明(1995—)，女，本科，主要從事林木遺傳育種研究。

* 通信作者：E-mail：gaocaiqiu@nefu.edu.cn

2016-06-21

* Corresponding author：E-mail：gaocaiqiu@nefu.edu.cn

S793.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.009