于海　馬龍利　陳可可

摘要：以姜油樹(shù)脂的粗分離物為原料，采用減壓梯度柱層析技術(shù)對(duì)粗分離物中的6-姜酚進(jìn)行分離純化，研究了洗脫劑種類(lèi)、填料比、洗脫劑濃度、硅膠顆粒目數(shù)等因素對(duì)6-姜酚含量及收率的影響。結(jié)果表明，以300～400目硅膠為填料，填料比為100，石油醚、正己烷及乙酸乙酯為洗脫劑，洗脫劑密度增量為0.005 g/mL，起始濃度范圍為0.695～0.725 g/mL，在此工藝參數(shù)下對(duì)6-姜酚進(jìn)行減壓梯度柱層析分離純化，可將其含量從55.03%提高到93.04%，收率大于83%。

關(guān)鍵詞：姜油樹(shù)脂；柱層析；6-姜酚

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）19-3717-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.030

Abstract： With ginger oleoresin of crude extracts as raw material，the crude extracts of 6-gingerol were separated and purified by decompression gradient column chromatography. The effects of types of eluent，ratio of filling，elution of gradient，filler particle mesh factors on the content and yield of 6-gingerol were studied. The results showed that 300-400 mesh silica gel was used as filler and the packing ratio was 100. Petroleum ether，hexane and ethyl acetate were used as eluents and the density increment of them was 0.005 g/mL and the initial concentration range was 0.695～0.725 g/mL. Under these process parameters，the content of 6-gingerol could be increased from 55.03% to 93.04% and the yield was higher than 83%.

Key words： ginger oleoresin； column chromatography； 6-gingerol

姜酚（Gingerols）是生姜（Zingiber officinale Rosc.）原料中天然存在的一類(lèi)辣味成分，呈黃色油狀液體，由含有羥基酮結(jié)構(gòu)的烷基鏈同系物組成的酚類(lèi)化合物[1]。作為生姜主要生物活性成分之一，姜酚在姜辣素中含量很高[2]。姜酚是一類(lèi)化合物，可分為單芳環(huán)和雙芳環(huán)庚烷2類(lèi)。前者主要包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和12-姜酚等10余種成分，后者包含許多成分，其結(jié)構(gòu)差異主要是芳環(huán)取代基不同。姜酚中6-姜酚含量最高，占姜酚類(lèi)物質(zhì)的75%以上[2]。鮮姜中，6-姜酚含量占總姜辣素80%以上[3]。研究表明，6-姜酚具有多種生物活性，如抗氧化[4]、抗誘變[5]、抗炎[6]、抗癌[7]、抗腫瘤[8]、驅(qū)寒、保肝利膽等作用[9]。6-姜酚可用于保健食品和治療心腦血管、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胃潰瘍等疾病的藥物[10]。

6-姜酚分離純化方法主要有硅膠柱層析法、大孔吸附樹(shù)脂法、聚酰胺柱分離法、分子蒸餾技術(shù)、制備型高效液相色譜法和高速逆流色譜法等[11-17]。6-姜酚的分離方法中運(yùn)用最多、最成熟的是柱層析法，這是由于柱層析法不僅可以得到豐富的組分信息，不破壞天然產(chǎn)物中原有成分，而且能分離結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似的化合物，分離出的組分純度較高[18，19]。既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定，又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備[20]。

目前，硅膠柱層析分離純化6-姜酚的研究中，不同洗脫劑、硅膠顆粒目數(shù)等因素對(duì)6-姜酚分離效果的試驗(yàn)研究較少，很多研究結(jié)果中都沒(méi)有涉及到6-姜酚的收率，且研究?jī)?nèi)容以小柱居多，缺少大規(guī)格層析柱純化6-姜酚的工藝參數(shù)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)，不利于6-姜酚大規(guī)模生產(chǎn)及制備。為了給企業(yè)利用大規(guī)格層析柱分離6-姜酚提供參考，本研究以普通精制硅膠為填料，采用減壓沖柱，洗脫劑梯度洗脫，對(duì)姜油樹(shù)脂的粗分離物（自制）進(jìn)行了純化試驗(yàn)研究，也為大規(guī)模生產(chǎn)制備6-姜酚奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

6-姜酚含量為55.03%粗分離物（自制），98% 6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品（天津中新藥業(yè)），GF254板（青島海洋化工廠），普通精制硅膠（青島鼎康硅膠有限公司），其余試劑為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

Aglient 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Aglient）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（美國(guó)BUCHI Labortechnik AG）；XP205電子分析天平（美國(guó)METTLER TOLEDO）；循環(huán)水式真空泵（山海予英儀器有限公司）；BZF50型真空干燥箱（Boxun）；60 mm×1 200 mm層析柱；Aglient 1260型HPLC。

1.3 方法

1.3.1 裝柱及上樣 稱(chēng)取適量硅膠，干法裝入層析柱（60 mm×1 200 mm）；按比例稱(chēng)取一定質(zhì)量的6-姜酚粗分離物（6-姜酚含量55.03%），加入1.5～2.0倍乙酸乙酯溶解，再加入2～3倍拌樣硅膠（40～80目），攪拌揮干，干法上樣。

1.3.2 洗脫 先向?qū)游鲋屑尤胧兔眩ǘ?lèi)）或正己烷進(jìn)行潤(rùn)柱，再用配好的洗脫劑（由石油醚、正己烷及乙酸乙酯配制成一定密度的溶劑）沖柱，洗脫劑密度單位增加量為0.005 g/mL，洗脫過(guò)程中采用薄板層析（TLC）進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 收集 當(dāng)點(diǎn)板顯色后樣品點(diǎn)與6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)水平位置重疊或平行時(shí)，開(kāi)始收集。當(dāng)樣品點(diǎn)變小、顏色變得很淺時(shí)，表明6-姜酚組分已基本全沖出，停止收集接液。

1.3.4 溶劑回收及樣品干燥 將沖柱后的洗脫劑進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，回收的溶劑可重復(fù)利用。含6-姜酚的收集液回收完溶劑后，放入40 ℃、0.08 MPa的真空干燥箱中干燥，用HPLC測(cè)定樣品中6-姜酚的含量。

1.4 檢測(cè)分析

1.4.1 高效液相色譜條件 Agilent高效液相色譜儀，色譜柱：迪馬Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 m）；乙腈-水（V/V=70∶30）為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 L。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱(chēng)取6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品20.30 mg，以色譜純甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶作標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精確移取適量標(biāo)準(zhǔn)品溶液于6個(gè)10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋至6個(gè)不同濃度水平的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。各標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣 10 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算峰面積平均值，以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回歸方程。最終得到回歸方程y=5 511.646 73x-17.16（R=0.999 99），結(jié)果表明6-姜酚在0.081 2～0.487 2 mg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 洗脫劑的選擇

以300～400目硅膠為填料，采用干法裝柱，在填料比（填料質(zhì)量與樣品質(zhì)量的比值）為40，沖柱時(shí)間為3～4 d，考察不同種類(lèi)洗脫劑對(duì)6-姜酚含量及收率的影響（表1）。結(jié)果表明，以正己烷和乙酸乙酯、石油醚和乙酸乙酯、石油醚和正己烷及乙酸乙酯配制的溶劑作洗脫劑進(jìn)行減壓梯度過(guò)柱分離，獲得的分離物中6-姜酚含量在83%左右，收率在92%左右，3種洗脫劑的分離效果差異不明顯。

2.2 填料比的選擇

以300～400目硅膠為填料，干法裝柱及上樣，以石油醚和正己烷及乙酸乙酯配制成洗脫劑，梯度范圍為0.670～0.710 g/mL，考察填料比對(duì)6-姜酚含量及收率的影響（圖1）。由圖1可知，隨著填料比的增加，純化物中6-姜酚含量隨之增加，6-姜酚收率是先增加后減小。這是因?yàn)樘盍媳仍黾樱?-姜酚組分與雜質(zhì)的分離度增大，所以純化物中6-姜酚含量增大。但填料增加，硅膠中6-姜酚的吸附量增加，導(dǎo)致純化物中6-姜酚收率降低。當(dāng)填料比為100時(shí)，純化分離物中6-姜酚的含量大于91%，收率大于92%，分離效果較好。

2.3 洗脫劑起始濃度

以300～400目硅膠為填料，填料比為100，以石油醚和正己烷及乙酸乙酯配制成不同密度的洗脫劑，從開(kāi)始更換梯度洗脫劑到6-姜酚沖完（TLC結(jié)果樣品點(diǎn)沒(méi)有6-姜酚）截止，考察洗脫劑密度梯度對(duì)洗脫劑用量的影響（圖2）。由圖2可知，隨著洗脫劑起始濃度（即密度）增加，6-姜酚含量先增加后降低，而收率是先降低再增加。當(dāng)洗脫劑起始濃度分別大于0.695 g/mL和0.725 g/mL時(shí)，雖然6-姜酚收率增大，但含量下降較大。這是由于洗脫劑密度增大極性增強(qiáng)，弱極性雜質(zhì)與6-姜酚不能有效分離，導(dǎo)致含量降低收率升高。當(dāng)洗脫劑起始濃度為0.695～0.725 g/mL時(shí)（洗脫劑密度增量為0.005 g/mL），6-姜酚含量最高，收率為90%左右，說(shuō)明該洗脫劑濃度對(duì)6-姜酚的分離效果好。

2.4 填料目數(shù)

以300～400目普通精制硅膠作填料時(shí)，洗脫劑流經(jīng)柱子時(shí)阻力過(guò)大，真空度在0.07～0.08 MPa，真空泵壓力較大，洗脫劑流速較低。因此，以100～200、200～400和300～400目硅膠為填料，石油醚和正己烷及乙酸乙酯配為洗脫劑，研究硅膠目數(shù)對(duì)6-姜酚分離效果的影響（表2）。由表2可看出，隨著填料顆粒目數(shù)減小，沖柱時(shí)間變短。這是因?yàn)樘盍夏繑?shù)變小，粒徑變大，填料間縫隙變大，孔道變多，洗脫劑流經(jīng)柱子時(shí)阻力減小，流速加快，沖柱時(shí)間就減小。以100～200、200～300目硅膠為填料時(shí)，沖柱后獲得的純化物中6-姜酚收率雖然比較高，分別為95.23%和93.22%，但含量較低，均低于90%。當(dāng)填料目數(shù)為300～400目時(shí)，過(guò)柱所得純化物中6-姜酚含量較高，為93.04%，但收率較低，僅為83.11%，這可能是由于起始接液點(diǎn)過(guò)晚，部分6-姜酚從柱內(nèi)沖出但未及時(shí)收集，導(dǎo)致6-姜酚收率降低，說(shuō)明硅膠目數(shù)越大，越有利于6-姜酚含量的提高。

3 結(jié)論

硅膠柱層析分離純化6-姜酚試驗(yàn)中，洗脫劑種類(lèi)對(duì)分離效果影響較小，增加了洗脫劑的選擇性，并可進(jìn)行自由組合；其次，填料比增大有利于6-姜酚含量的提高，但收率會(huì)有所降低，洗脫時(shí)間會(huì)增加。洗脫劑起始濃度對(duì)6-姜酚的分離效果也有較大影響，選擇合適的洗脫劑起始濃度，可獲得較高的6-姜酚含量及收率。

層析柱規(guī)格為60 mm×1 200 mm，300～400目硅膠為填料，填料比為100，石油醚、正己烷及乙酸乙酯配制成密度為0.695～0.725 g/mL的洗脫劑，單位增量為0.005 g/mL。在此工藝參數(shù)下進(jìn)行減壓梯度柱層析分離純化6-姜酚，可將其含量從55.03%提高到93%左右，收率在83%以上。

致謝：感謝貴州百靈制藥技術(shù)中心為試驗(yàn)研究提供的幫助和支持。

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