郭鳳英　李培鋒　賈俊濤

摘要：為研究?；悄懰幔═CA）對體外培養(yǎng)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的影響，探討其免疫調(diào)節(jié)作用，采用梯度離心法分離獲取小鼠胸腺細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)12 h后與不同濃度TCA共孵12 h。以流式細(xì)胞術(shù)對原代培養(yǎng)胸腺細(xì)胞早期凋亡進(jìn)行定量檢測；應(yīng)用分光光度法檢測了凋亡特異性蛋白酶Caspase-9、Caspase-3活性的變化。結(jié)果表明，TCA3組（終濃度為0.30 μg/mL）與胸腺細(xì)胞共孵12 h后，可極顯著抑制磷脂酰絲氨酸外翻，抑制細(xì)胞凋亡，TCA2組（終濃度為0.15 μg/mL）可顯著提高Caspase-9、Caspase-3活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。說明TCA通過對體外培養(yǎng)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。

關(guān)鍵詞：?；悄懰?；細(xì)胞凋亡；免疫調(diào)節(jié)

中圖分類號：R965 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）19-3706-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.026

Abstract： In this paper the study was aimed at discussing the immunoregulation of taurocholic acid（TCA） by analyzing its effects on mice thymocyte apoptosis. The mice thymocyte cells were isolated by gradient centrifugation and cultured under 37 ℃ with TCA of different concentration for 12 hours. Through flow cytometry（FCM），the thymocyte apoptosis in early stage were detected quantitatively. Besides，the activity of caspase-9 and caspase-3 were detected through spectrophotometric methods. The results showed that the TCA group 3（the final concentration：0.3 μg/mL） could dramatically restrain phosphatidylserine from eversion and restrain the cells apoptosis. Meanwhile，TCA group 2（the final concentration：0.15 μg/mL） could greatly improve the activity of caspase-9 and caspase-3，and induce the cells apoptosis. It indicated that TCA adjusts organism immune function by regulating the mice thymocyte apoptosis.

Key words： taurocholic acid （TCA）； mice thymocyte apoptosis； immune regulation

膽汁在中國醫(yī)藥上的應(yīng)用歷史悠久[1]。大量的藥理實驗表明，動物膽汁的主要藥理作用是由膽酸鹽和膽汁酸發(fā)揮的。牛磺膽酸（Taurocholic acid，TCA）是牛羊膽汁中的主要有效成分之一。研究表明TCA具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎作用，對心臟和血壓也具有一定的影響[2-4]。據(jù)報道[5]，TCA對機(jī)體免疫細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用。免疫細(xì)胞的凋亡在免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)中極為重要，已成為當(dāng)今免疫學(xué)研究的一個熱點。本試驗采用流式細(xì)胞等技術(shù)，研究不同濃度TCA對原代培養(yǎng)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的影響，探討TCA對機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用，從而為TCA的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 清潔級純種昆明小白鼠，體重（20±2） g，雌雄各半，由內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 ?；悄懰?，實驗室自制，純度達(dá)97%以上；淋巴細(xì)胞分離液，天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號LTS1077； Caspase-3分光光度法檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號KGA-203；Caspase-9分光光度法檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號KGA-403；Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號KGA-102。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（ELX800，BIO-TEKINSTUMENTS）；超凈工作臺（FLC-3，哈爾濱東聯(lián)公司）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，美國BD公司）；CO2培養(yǎng)箱（SERIE SⅡ，F(xiàn)orma Scientific，Inc.）。

1.1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗結(jié)果采用x±s表示，用SAS 9.0軟件處理數(shù)據(jù)，兩樣本比較采用t檢驗，樣本組間差異比較采用F檢驗。

1.2 方法

1.2.1 胸腺細(xì)胞的獲取 眼球放血處死后，75%乙醇浸泡2 min，無菌分離胸腺，去除小血管及結(jié)締組織，置于4 ℃培養(yǎng)液（含RPMI-1640培養(yǎng)基，5%滅活小牛血清，谷氨酞胺2 mmol/L，青霉素100 U/mL，鏈霉素0.2 mg/mL）中，在250目篩網(wǎng)輕輕研磨，離心（1 500 r/min，4 min），洗滌2次，重懸細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，計數(shù)并且調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×106個/mL，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板并使每孔終體積為1 mL，于5% CO2孵育箱中37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.2 試驗分組及處理 試驗動物隨機(jī)分為4組，每組5只，即空白對照組（胸腺細(xì)胞僅在完全培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)）；TCA 1組（TCA終濃度為0.03 μg/mL，與胸腺細(xì)胞共同孵育12 h）；TCA2組（TCA終濃度為0.15 μg/mL，與胸腺細(xì)胞共同孵育12 h）；TCA3組（TCA終濃度為0.30 μg/mL，與胸腺細(xì)胞共同孵育12 h）。

1.2.3 胸腺細(xì)胞早期凋亡的檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-PI雙染色法[6]，檢測TCA與胸腺細(xì)胞共孵育后凋亡早期磷脂酰絲氨酸外翻情況，進(jìn)而反映細(xì)胞早期凋亡百分率。

1.2.4 Caspase-9的活化程度的檢測 按常規(guī)方法制備胸腺細(xì)胞。將培養(yǎng)得到的胸腺細(xì)胞用PBS洗滌二遍（2 000 r/min，離心5 min）。按照試劑盒要求進(jìn)行操作。最后用酶標(biāo)儀在405 nm處測定其吸光度[7]。

1.2.5 Caspase-3的活化程度的檢測 方法同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCA對胸腺細(xì)胞早期凋亡的影響

由表1可見，不同濃度TCA與胸腺細(xì)胞共同孵育后，均能顯著抑制胸腺細(xì)胞凋亡（P<0.05），以TCA3組的抑制效果最好。

2.2 TCA對Caspase-9活化程度的影響

由表2可見，不同濃度TCA與胸腺細(xì)胞共同孵育后，TCA2組、TCA3組均可顯著誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡（P<0.05），TCA1組則無明顯影響（P>0.05）。

2.3 TCA對Caspase-3活化程度的影響

由表3可見，不同濃度TCA與胸腺細(xì)胞共同孵育后，TCA2組可顯著誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡（P<0.05），而TCA1、TCA3組則無明顯影響（P>0.05）。

3 小結(jié)與討論

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞凋亡啟動之初，分布于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）暴露于細(xì)胞膜外，利用該特性可定量檢測早期凋亡細(xì)胞[8]。試驗結(jié)果顯示，高劑量TCA可顯著抑制胸腺細(xì)胞磷脂酰絲氨酸的外翻，顯著降低細(xì)胞凋亡百分率。由此表明，TCA抑制胸腺細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻，阻止胸腺細(xì)胞的早期凋亡是通過其直接作用實現(xiàn)的。由于胸腺是T細(xì)胞分化、成熟的場所，在T細(xì)胞的分化和調(diào)節(jié)中起重要的作用[9，10]。因而提示，TCA可通過抑制胸腺細(xì)胞凋亡啟動階段，促進(jìn)機(jī)體T細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。

Caspase是一類凋亡特異性蛋白酶，分為啟動Caspase（如Caspase-9）和效應(yīng)Caspase（如Caspase-3）兩類，參與凋亡的啟動和執(zhí)行過程，它們的活化是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵[11]?；罨腃aspase-9引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3，其作為效應(yīng)子，作用于不同的靶分子，經(jīng)蛋白水解作用使細(xì)胞凋亡。試驗證實，TCA可顯著提高凋亡特異性蛋白酶Caspase-9、Caspase-3的活性，促進(jìn)胸腺細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果表明TCA誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡，該作用可能與上調(diào)胸腺細(xì)胞中Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡（apotosis）在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生、胸腺細(xì)胞的選擇等方面起著重要的作用。通過細(xì)胞凋亡機(jī)制的胸腺細(xì)胞陰性選擇，使大量未成熟的細(xì)胞包括自身反應(yīng)性T細(xì)胞得到清除，從而保持正常免疫功能狀態(tài)。試驗結(jié)果顯示，在胸腺細(xì)胞發(fā)生凋亡早期時，TCA可抑制其發(fā)生凋亡，使胸腺細(xì)胞分化增殖，參與免疫反應(yīng)。但隨著免疫反應(yīng)進(jìn)行到一定階段，也即胸腺細(xì)胞分化增殖到一定數(shù)量時，TCA 就開始誘導(dǎo)其凋亡，使免疫細(xì)胞維持在一定的數(shù)量水平而保證免疫反應(yīng)有序地進(jìn)行，從而使機(jī)體免疫系統(tǒng)保持穩(wěn)態(tài)。由此可知，免疫細(xì)胞對早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的反應(yīng)是截然不同的。綜上所述，TCA通過對不同階段胸腺細(xì)胞凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

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