劉曉燕 馬海玲 張詠梅 余 暉 巫靜華

(張家港市中醫(yī)醫(yī)院江蘇省企業(yè)研究生工作站，張家港，215600)

通脈散瘀凝膠提取物平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)的測定

劉曉燕 馬海玲 張詠梅 余 暉 巫靜華

(張家港市中醫(yī)醫(yī)院江蘇省企業(yè)研究生工作站，張家港，215600)

目的：測定通脈散瘀凝膠提取物及指標成分在不同溶劑中的平衡溶解度及不同pH下的表觀油水分配系數(shù)，探索通脈散瘀凝膠提取物的溶解性能。方法：采用沉淀法測定提取物的溶解度，以指標成分法測定提取物在不同溶劑中的平衡溶解度以及在正辛醇/水和正辛醇/緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)。結果：37 ℃時提取物在乙醇中的平衡溶解度較大，在緩沖液中呈先減小后增大趨勢；以指標成分來看，丹酚酸B和丹參素在pH緩沖液中溶解度先減小后增大，丹參酮ⅡA和隱丹參酮在pH 9時平衡溶解度達到最大；丹酚酸B和丹參素的油水分配系數(shù)隨pH增大而減小，丹參酮ⅡA和隱丹參酮在pH8時lgP達到最大。結論：通脈散瘀提取物在醇類中的溶解度較大，可考慮在處方中加入適量乙醇提高溶解度；pH影響提取物的油水分配系數(shù)，可通過調(diào)節(jié)pH值來促進其經(jīng)皮吸收。

平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)；通脈散瘀提取物

通脈散瘀凝膠處方來自臨床經(jīng)驗方，由丹參、紅花、川芎等6味藥組成。具有通脈止痛、活血消腫等功效。我們在中醫(yī)藥理論指導下，采用現(xiàn)代科技手段將其制成服用攜帶方便、質(zhì)量可控、藥理作用明確、臨床療效確切的外用凝膠劑。處方提取物中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素是君藥中發(fā)揮療效的主要藥效成分[1-2]，本實驗以4個指標成分的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)綜合評價提取物的溶解性能及理化性質(zhì)，以期為通脈散瘀凝膠經(jīng)皮給藥新劑型提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998紫外檢測器，Empower色譜工作站；色譜柱為Waters XBridge柱；AG135型電子天平(瑞士梅特勒公司)；FA1104N電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；AS20500A超聲清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；TDZ4-WS臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；DKZ-2型電熱恒溫震蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；PHS-3型pH計(上海儀電科學股份有限公司)

1.2 試劑 丹參酮ⅡA(批號：110766-201520)、隱丹參酮(批號：110852-200806)、丹酚酸B(批號：111562-201313)、丹參素(批號：110855-201412)，均購自中國食品藥品檢定研究院；磷酸(南京化學試劑有限公司)；氫氧化鈉(汕頭市西隴化工廠有限公司)；正辛醇(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；通脈散瘀提取物(由張家港市中醫(yī)醫(yī)院提供，批號：20150907)；甲醇(色譜純，山東禹王試劑有限公司)、乙腈(色譜純，德國Merck公司)，水為雙蒸水，乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿均為分析純

2 方法與結果

2.1 丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素含量測定方法的建立[3-6]

2.1.1 色譜條件 Waters XBridge色譜柱，流動相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫：0～8 min，8%～18%A；8～15 min，18%～21%A；15～20 min，21%～30%A；20～25 min，30%～40%A；25～45 min，40%～75%A；45～60 min，75%A，體積流量為1 mL/min，進樣10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm。

2.1.2 對照品溶液的配置 精密稱取丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素對照品適量，加75%甲醇制成每1 mL含丹參酮ⅡA0.05 mg、隱丹參酮0.053 mg、丹酚酸B0.066 mg、丹參素0.064 mg的混標溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取提取物0.1 g，置10 mL容量瓶中，加75%甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.1.4 陰性供試品溶液的制備 制備缺丹參的通脈散瘀提取物，精密稱取0.1 g，置10 mL容量瓶中，加75%甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.1.5 標準曲線的繪制 精密吸取混合對照品適量，加75%甲醇稀釋制成系列對照品溶液。分別進樣10 μL，按2.1.1項下色譜條件進行測定。以進樣量為橫坐標(X)，以相應峰面積為縱坐標(Y)，進行回歸處理，得回歸方程，結果見表1。

表1 標準曲線與線性范圍

2.1.6 專屬性考察 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，按照2.1.1項下色譜方法測定。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上有相同保留時間的色譜峰，陰性對照無干擾。

2.2 平衡溶解度的測定[7-8]

2.2.1 重量法 取通脈散瘀提取物約1 g，精密稱定，置于西林瓶中，加入10 mL不同溶劑，始終保持有固體物存在，塞上塞子，放入恒溫水浴振蕩器中振搖24 h，溫度保持37 ℃，使其達到充分溶解。將西林瓶中的藥液連同殘留的固體藥物一同轉(zhuǎn)移至已經(jīng)恒定質(zhì)量的離心管中，4000 r/min離心10 min，傾出上清液，底部殘渣連同離心管在70 ℃烘干至恒重，稱定重量，計算提取物在不同溶劑中的平衡溶解度。平衡溶解度=(m加入量-m未溶解量)/V溶劑體積。選擇的溶劑有水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正辛醇、三氯甲烷，pH分別為3.11、3.94、4.99、6.71、7.46、8.02、8.95、10.18的緩沖液。提取物在水及有機溶劑中的溶解度見圖1，在緩沖液中的溶解度見圖2。由圖1可知提取物在乙醇中的平衡溶解度較好，水和丙酮中次之；在緩沖液中隨pH值增加平衡溶解度呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。

圖1 提取物在37 ℃不同溶劑中的平衡溶解度

圖2 提取物在37 ℃不同pH緩沖液中的平衡溶解度

2.2.2 指標成分法[9-10]取2.2.1項下所得上清液5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋搖勻定容至刻度。12 000 r/min離心，上清液照2.1.1項下色譜方法進行測定，計算丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素在不同溶劑中的平衡溶解度。4個指標成分在有機溶劑中的溶解度見表1，在不同緩沖液中的平衡溶解度見圖3，圖4。結果顯示，37 ℃時丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B及丹參素在甲醇中的溶解度最大；在緩沖體系中丹酚酸B及丹參素的溶解度受pH影響較大，丹參酮ⅡA及隱丹參酮的溶解度變化較小。

2.3 表觀油水分配系數(shù)的測定[11-12]稱取通脈散瘀提取物適量，至10 mL容量瓶中，分別加入被正辛醇飽和的水和不同pH值的PBS緩沖液超聲30 min，使其充分溶解，用相同溶劑定容至刻度，保證一直有固體藥物存在，使其呈飽和狀態(tài)，靜止后離心(5 000 r/min，10 min)，取上清液2 mL，氮氣吹干，加75%甲醇5 mL，渦旋5 min，離心(5 000 r/min，10 min)取上清液過0.45 μm濾膜，測定其中指標成分的濃度為C0，再取上清液5 mL至具塞錐形瓶中，分別加入5 mL被水飽和過的正辛醇溶液，塞上塞子，放入恒溫水浴振蕩器中，溫度保持在37 ℃，振搖24 h，靜止后取上層油相2 mL，氮氣吹干，加75%甲醇5 mL，渦旋5 min，離心(5 000 r/min，10 min)取上清液過0.45 μm濾膜，測定其中指標成分的濃度為C1。按照公式計算表觀油水分配系數(shù)(P)，計算公式如下：P=C1V1/(C0V0-C1V1)，結果見圖5、圖6。丹酚酸B和丹參素的油水分配系數(shù)在pH值8以后趨于平緩，而丹參酮ⅡA和隱丹參酮的油水分配系數(shù)成鋸齒狀變化。

表2 丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素在37 ℃不同有機溶劑中的溶解度

圖3 丹酚酸B和丹參素在不同pH緩沖液中的平衡溶解度

圖4 丹參酮ⅡA和隱丹參酮在不同pH緩沖液中的 平衡溶解度

圖5 丹酚酸B和丹參素在37 ℃下不同 pH的緩沖液中的lgP值

圖6 丹參酮ⅡA和隱丹參酮在37 ℃下不同 pH的緩沖液中的lgP值

3 討論

中藥提取物含多個及多種性質(zhì)不同的化合物，這些化合物之間存在增溶、助溶、競爭性抑制等相互作用，因此中藥提取物的溶解過程極其復雜。溶解是吸收的前提，藥物的溶解度是影響藥物吸收分布的重要因素之一。表觀油水分配系數(shù)是影響藥物經(jīng)皮吸收的重要因素，是藥物傳遞系統(tǒng)中的重要參數(shù)[13]。本實驗結合重量法和搖瓶法，同時測定了通脈散瘀提取物及指標成分的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)，能較好地反映提取物的溶解性能。

采用重量法考察提取物在不同溶劑及不同pH緩沖液中的平衡溶解度，由圖1可以看出，提取物在乙醇和水中的溶解度較大，表明提取物在偏極性的溶劑中溶解較好，提示在設計凝膠處方時適當加入乙醇可提高其溶解度。圖2表明提取物在pH 3.11～6.71范圍內(nèi)溶解度逐漸減小，而在pH 6.71～10.18范圍內(nèi)溶解度逐漸增加，說明pH對藥物溶解度有較大影響，在劑型設計中應考慮pH值不同給藥物溶解度帶來的影響。

提取物中丹參素和丹酚酸B在不同pH緩沖液中的溶解度均呈現(xiàn)隨pH值增加先減小后增大的趨勢。丹參素是β-3,4-二羥基苯乳酸，丹酚酸B是由3分子丹參素與1分子咖啡酸縮合而成，二者均是多酚基化合物。在酸性條件下，丹參素和丹酚酸B均以原型存在，其水溶性較好，溶解度較高，在中性環(huán)境下溶解度較低。有文獻報道[14]稱丹參素在pH6.8的緩沖液體系中可能分解為其他物質(zhì)，具體原因待進一步探討。隨著pH值增加，二者溶解度逐漸增大。有文獻指出，丹酚酸類成分在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定，易分解及轉(zhuǎn)化，與本實驗結果有出入，原因可能是組方中的其他化學成分對丹酚酸類成分起到了穩(wěn)定作用，下一步需進行全面仔細的組方分析，這同時也從另一方面反映了通脈散瘀組方的合理性。丹參素和丹酚酸B的水溶性良好，這也導致其脂溶性較弱。由圖5可以看出，在由正辛醇和緩沖液組成的油水分配系統(tǒng)中，二者的lgP值均較低，范圍為-3.59時溶解度又逐漸上升呈平穩(wěn)趨勢，而二者的油水分配系數(shù)則呈鋸齒狀變化。丹參酮ⅡA和隱丹參酮單體化合物脂溶性較強，但由本實驗結果圖6可以看出，二者的lgP值在-1到0之間，而文獻報道[15]藥物吸收的最佳范圍是-1

由平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)測定結果可知，通脈散瘀提取物及指標成分的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)受pH值影響較大，部分指標的滲透性較差，故在處方設計時應注意調(diào)節(jié)pH值及添加合適的吸收促進劑，以提高通脈散瘀處方的透皮吸收效果。

[1]徐蘭,何雙鳳,孫勇兵,等.杏香兔耳風提取物基本理化性質(zhì)研究[J].中成藥,2012,34(6):1061-1067.

[2]喬建衛(wèi),裴廣慶,劉向東,等.黃芩總黃酮溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測定[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2013,33(24):2026-2031.

[3]黃海英,于定榮,王春國,等.斯皮諾素表觀油水分配系數(shù)的測定[J].藥物分析雜志,2014,34(3):497-502.

[4]朱美玲,劉洋,曹燕飛,等.葛根芩連片主要活性成分的溶解度及油水分配系數(shù)的測定[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2014,16(12):2686-2692.

[5]胡昌勤,潘瑞雪.溶出度試驗評價/預測固體口服制劑生物等效性的研究進展[J].中國新藥雜志,2014,23(1):44-50.

[6]張洪超,李偉,馬曉慧,等.丹參水溶性成分間相互轉(zhuǎn)化及相互作用研究進展[J].醫(yī)學綜述,2014,20(9):1647-1652.

[7]吳玉強,王志萍,熊萬娜,等.秋水仙堿油水分配系數(shù)和平衡溶解度的測定[J].中國實驗方劑學雜志,2016,22(5):64-67.

[8]李慧芳,張冬,曲文君,等.4種黃酮類中藥有效成分BCS分類及吸收機制的初步研究[J].中國中藥雜志,2016,41(7):1198-1202.

[9]李俊生,呂佳佳,王興慧,等.黃芩總黃酮及其單體的溶解性及體外經(jīng)皮滲透性能研究[J].中草藥，2014,45(2)：200-205.

[10]朱慧,耿婷,張麗,等.荊芥內(nèi)酯平衡溶解度和油水分配系數(shù)的測定[J].中國中藥雜志,2010,35(23):3144-3148.

[11]任玉芳，畢仁杰，項峰.注射用丹參多酚酸鹽與其他藥物配伍禁忌分析[J].中國醫(yī)藥，2016，11(3)：427-430.

[12]范雪亮.丹參多酚酸鹽藥理及臨床應用[J].中國醫(yī)藥，2012,7(10)：1343-1344.

[13]王景雁,蘭頤,林紅梅,等.薄荷醇對不同logP值中藥有效成分經(jīng)皮吸收的促透研究[J].中國新藥雜志,2016,25(2):202-205.

[14]彭九嫚,柴堯,潘旻,等.丹參中酚酸類成分在不同工藝條件下轉(zhuǎn)化關系[J].2016,22(5):67-72.

[15]郁丹紅,賈曉斌.相似性分析用于丹參二萜醌組分平衡溶解度和油水分配系數(shù)的研究[J].中國中藥雜志,2013,38(12):1860-1867.

TheDeterminationofEquilibriumSolubilityandApparentOil-waterPartitionCoefficientonTongmaisanyuExtract

Liu Xiaoyan，Ma Hailing，Zhang Yongmei，Yu Hui，Wu Jinghua

(ZhangjiagangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Zhangjiagang215600，China)

Objective:To determine Tongmaisanyu gel extract and index components in different solvents′ equilibrium solubility and apparent partition coefficient in different pH to explore the solvent performance of Tongmaisanyu extract.MethodsTaking the precipitation method for the determination of the solubility of the extract and equilibrium solubility of index components in different solvents as well as partition coefficient in n-octanol / water and n-octanol / buffer.ResultsThe equilibrium solubility of the extract in ethanol was higher at 37 ℃, and it decreased first and then increased in buffer; the solubility of salvianolic acid B and danshensu in pH buffer decreased first and then increased, and the equilibrium solubility of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone was the highest at pH 9; the oil-water partition coefficient of salvianolic acid B and danshensu decreased with the increase of pH, and the lgP of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone reached the maximum at pH8.ConclusionTongmaisanyu extract dissolves greater in alcohols, so adding an appropriate amount of ethanol in the formulation to increase the solubility may be favorable. And pH can affect the partition coefficient, so for percutaneous absorption may be promoted by adjusting the pH values.

Equilibrium; Oil-water partition coefficient; Tongmaisanyu extract

蘇州市科技發(fā)展計劃項目(SYSD2015165)

劉曉燕(1983.06—)，女，本科，主管中藥師，研究方向:中藥新制劑與新劑型，E-mail：467531548@qq.com

R284

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.048

(2016-07-20收稿 責任編輯：洪志強)