周法東，劉憲軍，來創(chuàng)業(yè)，劉本發(fā),劉麗萍,李利元

(滄州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，河北 滄州 061001)

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測阿膠棗中的阿膠成分

周法東，劉憲軍，來創(chuàng)業(yè)，劉本發(fā),劉麗萍,李利元

(滄州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，河北 滄州 061001)

建立阿膠棗中阿膠成分的檢測方法。采用胰蛋白酶對阿膠棗中阿膠中的蛋白進(jìn)行酶解，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對阿膠的特征肽段進(jìn)行檢測，選擇電噴霧正離子(ESI+) MRM模式對阿膠的特征肽段離子m/z539.8(雙電荷)→612.4和m/z539.8(雙電荷)→923.8 進(jìn)行檢測。該方法可用于阿膠棗中阿膠的檢測，最低可檢出濃度為含2%阿膠的阿膠棗樣品。

液質(zhì)聯(lián)用；阿膠棗；阿膠；特征離子峰

阿膠(Collacoriiasini)為馬科動物驢(EquusasinusL.)的干皮或鮮皮經(jīng)去毛熬制而成,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為補(bǔ)血“圣藥”，主治血虛萎黃,眩暈心悸,肌痿無力,心煩不眠,虛風(fēng)內(nèi)動,肺燥咳嗽,癆咳咯血,吐血尿血,便血崩漏,妊娠胎漏。阿膠棗是以正宗阿膠和金絲小棗為主要原料精制而成，含多種果糖、維生素、葡萄糖、微量元素，是一種老幼皆宜的保健食品。但是目前少數(shù)一些企業(yè)標(biāo)稱為阿膠棗，但在加工阿膠棗的過程中少添加或沒有添加阿膠甚至添加假冒偽劣的阿膠產(chǎn)品，導(dǎo)致了其產(chǎn)品中缺少了部分保健功效。本研究根據(jù)膠原蛋白序列差異來鑒別產(chǎn)品的質(zhì)量差異，以期為市場監(jiān)督部門提供技術(shù)依據(jù)，維護(hù)市場公平公正以及保護(hù)消費(fèi)者利益[1-2]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈均為色譜純，購于賽默飛世爾科技有限公司；碳酸氫鈉為分析純，購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶為序列分析純，購于Promega公司；阿膠、黃明膠均購于東阿阿膠股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

島津8030高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、配備四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、恒溫柱溫箱、電噴霧電離源(島津公司)；DiamonsilC18色譜柱(150mm×2.1mm，5μm) (北京迪馬科技有限公司)；Milli-Q密理博超純制水機(jī)(默克密理博公司)；M37610-33渦旋混合器(賽默飛世爾科技有限公司)；BK-80A超聲波振蕩器(濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司)；湘智TGL21M高速離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

流動相流速0.3mL/min，進(jìn)樣量：5μL，柱溫：40℃，以0.1%甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫：0～25min，A 95%→80%，B 5%→20%；25～40min，A 80%→50%，B 20%→50%。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子 (ESI+) MRM模式；選擇阿膠特征離子峰m/z539.8(雙電荷)→612.4和m/z539.8(雙電荷)→923.8作為監(jiān)測離子對；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：540L/h。

1.3.3 阿膠棗的制備

取一定量阿膠粉碎，放入容器中加少量水，加熱3～4min，待阿膠全部化開后，加入20 g量紅糖攪拌，直至紅糖全部溶化，接著把200 g去核金絲棗放入，加熱10min，并把棗不停翻動攪拌，待漿液全部掛到棗上為止。

1.3.4 樣品前處理

樣品的制備，將樣品放入粉碎機(jī)中絞碎，準(zhǔn)確稱取混合均勻試樣約5 g(精確到0.01g)加1% 碳酸氫銨溶液40mL，超聲處理30min，濾紙過濾，取濾液放入50mL比色管中，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析級胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成每1mL中含1mg的溶液，臨用前現(xiàn)配)10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12h，即得。

對照阿膠的制備，取阿膠對照藥材粉末0.1 g，放入50mL比色管中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析級胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成每1mL中含1mg的溶液，臨用前現(xiàn)配)10μL，搖勻，37℃恒溫酶解12小時，即得。[3-9]

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先對特征離子進(jìn)行全掃描，得到特征離子的雙電荷分子離子峰。以雙電荷分子離子為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜采集。將二級質(zhì)譜中豐度較高的2個特征離子m/z 612.4 和m/z923.8 作為檢測離子對，如圖1。以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式對傳輸電壓和碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化。[10-11]

表1 質(zhì)譜分析條件

圖1 阿膠特征離子m/z539.8的二級質(zhì)譜圖

2.2 陰性樣品和干擾性試驗

用水晶蜜棗(不含阿膠成分)和黃明膠對照藥材作為陰性樣品，以阿膠對照藥材、阿膠棗為陽性樣品，選擇阿膠特征分子離子峰m/z 539.8(雙電荷)→612.4和m/z 539.8(雙電荷)→923.8作為檢測離子對進(jìn)行測定，結(jié)果水晶蜜棗陰性、黃明膠樣品的色譜圖中，在與阿膠對照藥材及阿膠棗樣品相應(yīng)的位置上無相應(yīng)的色譜峰，認(rèn)為水晶蜜棗陰性樣品(不含阿膠成分)及黃明膠對阿膠棗樣品測定無干擾(見圖2～5)。

圖2 阿膠對照品特征分子離子色譜圖

圖3 阿膠棗特征分子離子色譜圖

圖4 水晶蜜棗色譜圖

圖5 黃明膠特征分子離子色譜圖

2.3 樣品檢測限的確定

按照“1.3.3”方法分別制得含0%、1%、2%、 5%、10%阿膠的阿膠棗系列，按照“1.3.4”方法進(jìn)行前處理，以阿膠特征離子峰m/z 539.8 (雙電荷)→612.4 和m/z 539.8(雙電荷)→923.8作為檢測離子對進(jìn)行檢測(如圖6～9)所示，含2% 阿膠的阿膠棗中，特征分子離子峰的信噪比為3：1，故檢測限規(guī)定為: 在MRM 模式下，最低檢出濃度為含2%阿膠的阿膠棗。

圖6 阿膠含量1%阿膠棗色譜圖

圖7 阿膠含量2%阿膠棗色譜圖

圖8 阿膠含量5%阿膠棗色譜圖

圖9 阿膠含量10%阿膠棗色譜圖

2.4 方法的準(zhǔn)確度試驗

分別制備添加2%、5%、10%的阿膠棗各6份樣品，按“1.3.4”方法進(jìn)行前處理，分別進(jìn)樣，以阿膠特征離子峰m/z 539.8 (雙電荷)→612.4 和m/z 539.8(雙電荷)→923.8 作為檢測離子對進(jìn)行檢測，特征離子峰峰面積的RSD如表2所示。

表2 方法準(zhǔn)確度試驗

3 結(jié)論

本文所建立的特征分子離子檢測方法高效、快速，可以有效地對阿膠棗中阿膠成分進(jìn)行檢測。本文所的相關(guān)檢測方法也可以應(yīng)用于其他食品的質(zhì)量控制和市場監(jiān)管，對提升產(chǎn)品的質(zhì)量維護(hù)消費(fèi)者經(jīng)濟(jì)權(quán)益等方面也有重要意義。

[1] 杜效華,朱紅.阿膠龜板膠鹿角膠黃明膠的鑒別[J].山東中醫(yī),1994,13(7):317.

[2] ChP 2010.VolⅠ(中國藥典2010.一部)[S].2010:912.

[3] ZHOU Y( 周巖，ZHAO YG(趙永剛)，ZHANG BB(張蓓蓓)et al.Determination of triphenylmethane dye residues in water by ultraperformance liquid chromatography-triple quadrupole linearion trap mass spectrometry(超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜測定水樣中三苯甲烷類及代謝物)[J].Chin JAnal Chem(分析化學(xué))，2014，42(3)：367.

[4] 王前,張貴鋒,劉濤,劉永東,馬潤宇,蘇志國.基于串聯(lián)質(zhì)譜的魚皮明膠鑒別研究[J].中國生物工程,2009,29(6):101-107.

[5] 孫愛梅,張貴鋒,倪文,蘇志國.膠原蛋白降解物高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析[J].中國生物工程,2005，25(2):66-72.

[6] 崔琳,張貴鋒,劉濤,閉靜秀,馬潤宇,蘇志國.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法分析不同年齡鼠皮膚中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白相對含量[J].中國生物工程,2007,27(4):71-76.

[7] CHENG XL(程顯隆)，LI WJ(李文杰)，ZHANG Xiao-long(張小龍)，et al.Identification of bovine-hide gelatin from glue of tortoise shell and deer-horn gelatin by UPLC-QTOF-MS and principal component analysis (UPLC-QTOF-MS結(jié)合主成份分析法用于龜甲膠、鹿角膠中添加牛皮源成分的檢測研究)[J].Chin J Pharm Anal(藥物分析)，2012，32(6):931.

[8] CHENG XL(程顯隆).Key Technology Research Glue Medicine Quality Control(膠類藥材質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)研究)[D].Beijing(北京).Beijing University of Chinese Medicine(北京中醫(yī)藥大學(xué))，2014.

[9] 陳佳,陳顯隆,魏鋒,張倩倩,馬雙成.超高效液相色譜——三重四極桿質(zhì)譜法檢測復(fù)方阿膠漿中阿膠[J].藥物分析,2015,35(2):328-332.

[10] CHENG XL，WEI F，CHEN J，et al．Using the doubly charged selected ion coupled with MS/MS fragments monitoring(DCSI-MS /MS) mode for the identification of gelatin species[J].J Anal MethodsChem，2014:764397.doi:10.1155 /2014 /764397.

[11] CHENG XL，WEI F，XIAO XY，et al.Identification of five gelatins by ultra performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry(UPLC/Q-TOF-MS)using principal component analysis[J].J Pharm Biomed Anal，2012，62:191.

Liquidchromatographytandemmassspectrometryanalysisofdonkey-hideglueinEjiaojujube

ZHOUFa-dong,LIUXian-jun,LAIChuang-ye,LIUBen-fa,LIULi-ping,LILi-yuan

(CangzhouInstituteofProductQualitySupervisionandInspection，Cangzhou061001，China)

To establish an analytical method for identification of donkey-hide glue in Ejiao jujube.The use of trypsin gelatin Ejiao jujube in protein digestion，the use of high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry characteristics of Ejiao peptides were detected，choose positive electrospray ionization (ESI+) MRM mode characteristics of gelatin peptide ion m/z 539.8→612.4 and m/z539.8→923.8 for testing.This method can be used donkey-hide glue in Ejiao jujube detection，can be detected at a concentration of Ejiao jujube sample containing 2% donkey-hide glue in.

Liquid chromatography tandem mass spectrometry(LCMS/ MS)；Ejiao jujube；Donkey-hide glue；Characteristic ion peak

2017-08-22

河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技計劃(2012ZD11)

周法東(1958-)，男，正高級工程師，主要從事質(zhì)量管理，食品檢驗工作.

劉憲軍(1981-)，男，工程師，碩士，從事食品檢驗工作.E-mail: liuxianjun1981@163.com

李利元(1970-)，男，高級工程師，本科，主要化學(xué)分析，食品檢驗工作.

1001-9383(2017)03-0052-06

O657.63

A