孫緒，姚成芬，付思紅，鞏仔鵬，劉亭，楊暢，查俊，李勇軍#（.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽550004；.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽550004）

苗藥朱砂根的HPLC指紋圖譜研究Δ

孫緒1，2＊，姚成芬1，3，付思紅1，3，鞏仔鵬1，劉亭1，楊暢1，查俊3，李勇軍3#（1.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽550004；3.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽550004）

目的：建立苗藥朱砂根的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為甲醇-水（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。以11-O-（3，′4，′5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素為參照，測定16批藥材樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評價(jià)，并就指紋圖譜進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：16批朱砂根藥材的HPLC圖譜有6個(gè)共有峰，其中8批藥材樣品的相似度均＞0.9；16批朱砂根藥材可聚為4類。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為朱砂根藥材的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。

朱砂根；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析

朱砂根又名八爪金龍，為紫金?？浦参镏焐案鵄rdisia crenata Sims.的干燥根及根莖，主要成分為三萜皂苷、鞣質(zhì)、糖類等[1]，具清熱解毒、散瘀止痛、祛風(fēng)除濕之功效，臨床多用于咽喉腫痛、扁桃體炎、風(fēng)濕骨痛等癥的治療[2]，收載于2015年版《中國藥典》（一部）[3]和2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[4]。2015年版《中國藥典》（一部）僅收載了朱砂根藥材中巖白菜素含量的測定方法，為進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本課題組在前期研究[5]的基礎(chǔ)上收集了具有代表性的貴州省不同產(chǎn)地朱砂根藥材，采用分析效能高、速度快且應(yīng)用較廣的高效液相色譜法（HPLC）建立了指紋圖譜[6-9]，并就結(jié)果進(jìn)行了聚類分析。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包含二極管陣列檢測器、四元梯度泵、脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、ChemStation色譜工作站（美國Agilent公司）；Me AE240型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試劑

巖白菜素、11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素對照品均為貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)核磁共振、紅外光譜檢測，質(zhì)譜分析確證其結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC法檢測純度均＞98%；試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

16批朱砂根藥材采自貴州省不同產(chǎn)地（見表1），由貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為真品。

表1 朱砂根藥材來源Tab 1 The sources ofA.crenata

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，5%→15%A；5～10 min，15%→20%A；10～30 min，20%→40%A；30～45 min，40%→60%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液分別稱取待測成分對照品適

量，加甲醇制成巖白菜素、11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子?；?巖白菜素質(zhì)量濃度分別為0.496 4、1.061 0 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取藥材樣品粉末（過40目篩）1 g，精密稱定，精密加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取2 h，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，6個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子?；?巖白菜素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，6個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批藥材樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子酰基）-巖白菜素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，6個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成取16批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對16批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 16批藥材樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed chromatograms of 16 batches of medicinal materials

2.4.2 相似度分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對16批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析，詳見表2。結(jié)果，16批藥材樣品中有8批差異較小，相似度均＞0.9；另外4批藥材樣品相似度在0.7～0.9之間；還有4批藥材樣品相似度在0.2～0.4之間。表明不同產(chǎn)地朱砂根藥材化學(xué)成分差異較大。

圖2 藥材樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 2 Control HPLC Fingerprint of samples

2.4.3 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對16批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，16批藥材樣品有6個(gè)共有峰，通過對照品HPLC圖譜確定4號峰為巖白菜素，5號峰為11-O-（3′，4′，5′-三羥基沒食子?；?巖白菜素。以5號峰為參照峰，計(jì)算其他共有峰與5號峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，詳見表3、表4。

表2 16批藥材樣品相似度評價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity evaluation of 16 batches of samples

表3 16批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時(shí)間Tab 3 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprints of 16 batches of samples

表4 16批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 4 Relative peak areas of common peaks in n HPLC fingerprints of 16 batches of samples

2.5 聚類分析

就HPLC指紋圖譜中各共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件中系統(tǒng)聚類法（Hierarchical cluster）的Ward法中歐氏距離平方法（Squared euclidean distance）對16批藥材樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，繪制樹狀圖，詳見圖3。

圖3 16批藥材樣品的聚類分析樹狀圖Fig 3 Cluster analysis of 16 batch of medicinal materials samples

由圖3可知，16批不同產(chǎn)地藥材樣品在距離為5的條件下可以分為4類：第1類藥材樣品7批（S2、S9、S10、S11、S14、S15、S16），其相似度均＞0.9，此類藥材樣品中巖白菜素含量都普遍較高；第2類藥材樣品4批（S3、S4、S5、S7），相似度在0.2～0.4之間，此類藥材樣品中巖白菜素含量很低；第3類藥材樣品4批（S1、S6、S8、S13），相似度在0.7～0.9之間，此類藥材樣品中巖白菜素含量介于前2類之間；第4類藥材樣品1批（S12），雖然其相似度在0.9以上，但其2號共有峰含量明顯高于其他批藥材樣品，化學(xué)成分信息量也較為全面，因此聚為一類。

3 討論

本課題組采用HPLC法建立了苗藥朱砂根的指紋圖譜分析方法。試驗(yàn)中對流動相、洗脫梯度、流速、柱溫等色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，在優(yōu)化后的色譜條件下，各待測成分峰達(dá)到較好分離且基線平穩(wěn)；并考察了提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間等供試品溶液制備方法，得到了最適合的條件。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，所建立的朱砂根藥材指紋圖譜分析方法準(zhǔn)確、可靠。

相似度評價(jià)法是以兩者中若干共有的、具有特征的指標(biāo)作為統(tǒng)一尺度，運(yùn)用適當(dāng)?shù)呐卸ㄔ瓌t來描述兩者之間匹配程度的方法[10-12]；聚類分析法是根據(jù)相似程度大小將樣品歸類，在中藥的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評價(jià)及品種分類等方面均有應(yīng)用[13-16]。本研究就所鑒定的16批朱砂根藥材樣品的指紋圖譜進(jìn)行了相似度評價(jià)及聚類分析，由相似度評價(jià)結(jié)果可見，其中有4批藥材樣品相似度較低，差異較大，而造成該差異的主要因素是各共有峰含量的差異；聚類分析結(jié)果準(zhǔn)確地將各批藥材歸類，達(dá)到了質(zhì)量評價(jià)及品種分類的目的。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為朱砂根藥材的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。

[1] 陳尚钘，胡文杰，黃艷麗，等.朱砂根化學(xué)成分的初步分析[J].江西林業(yè)科技，2007，21（6）：15-17.

[2] 貴州省中藥普查辦公室.貴州中藥資源[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1992：785.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：138.

[4] 貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].貴陽：貴州科技出版社，2003：164.

[5] 李勇軍，夏彬，龍慶德，等.朱砂根主要活性成分的含量測定研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（8）：1929-1931.

[6] 賈成友，趙鳳平，李微，等.HPLC指紋圖譜結(jié)合共有模式識別評價(jià)重慶市售青蒿飲片質(zhì)量的一致性[J].中國藥房，2015，26（27）：3828-3831.

[7] 涂興明，吳涵，吳康郁.中藥指紋圖譜的研究與應(yīng)用[J].海峽藥學(xué)，2016，28（5）：1-4.

[8] 婁濤濤，陀揚(yáng)凌，金玲，等.黑果枸杞及其偽品白刺果的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2016，27（9）：1245-1248.

[9] 羅文匯，劉布鳴，彭麗詩，等.石柑子藥材的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2016，27（33）：4701-4704.

[10] 孫國祥，閆波，侯志飛，等.中藥色譜指紋圖譜評價(jià)方法研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2015，13（7）：673-681.

[11] 關(guān)洪月，李林，劉曉，等.中藥指紋圖譜相似度計(jì)算方法探析[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（18）：282.

[12] 孫國祥，張玉靜，孫萬陽，等.中藥一致性評價(jià)關(guān)鍵問題：中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑制模式和定量指紋圖譜檢查項(xiàng)[J].中南藥學(xué)，2015，13（10）：1026-1032.

[13] 朱曉勤，尹蓮.化學(xué)模式識別在中藥分類和質(zhì)量評價(jià)中的應(yīng)用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（10）：2111.

[14] 黃琪，黃彩虹，雷鵬，等.地錦草藥材HPLC指紋圖譜及模式識別研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（12）：95-97.

[15] 潘偉東，杜義龍，趙勝男，等.韓信草的高效液相色譜指紋圖譜及化學(xué)模式識別[J].藥物分析雜志，2015，35（2）：250-252.

[16] 吳玲芳，林琛，袁永兵，等.葉下珠指紋圖譜及模式識別研究[J].中草藥，2015，46（4）：572-575.

Study on HPLC Fingerprint of Miao Medicine Ardisia crenata

SUN Xu1，2，YAO Chengfen1，3，F(xiàn)U Sihong1，3，GONG Zaipeng1，LIU Ting1，YANG Chang1，ZHA Jun3，LI Yongjun（31.Guizhou Provincial Key Lab of Pharmaceutic Preparation，Guiyang 550004，China；2.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education/National Engineering Research Center of Miao Medicines，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprints of Miao medicine Ardisia crenata.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consiste of methanol-water（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 220 nm，and column temperature was maintained at 30℃.The sample size was 10 μL.Using 11-O-（3，′4，′5′-three-o-galloylhyperin）-bergeninum as reference，HPLC fingerprints of 16 batches of samples were determined.Common identification and similarity evaluation were performed by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation Software（2012 edition）.Cluster analysis of fingerprrints was conducted.RESULTS：There were 6 common peaks in HPLC fingerprints of 16 batches of samples.The similarity among 8 batches was more than 0.9.The 16 batches of samples could be clustered into 4 categories.CONCLUSIONS：Established fingerprints can provide reference for identification and quality evaluation of A.crenata.

Ardisia crenata；HPLC；Fingerprint；Cluster analysis

R284

A

1001-0408（2017）30-4285-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.29

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.黔科合平臺人才〔2016〕5613、5677）；貴州省教育廳項(xiàng)目（No.黔教合協(xié)同創(chuàng)新字〔2013〕04、黔科合KY字〔2013〕122、黔教研合ZYRC字〔2014〕012）；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項(xiàng)（No.黔科合人字〔2015〕11號）

＊碩士研究生。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。電話：0851-86908468。E-mail：928763710@qq.com

#通信作者：教授。研究方向：天然產(chǎn)物活性。電話：0851-86908468。E-mail：liyongjun026@126.com

2017-01-10

2017-02-18）

（編輯：張靜）