清痹顆粒的HPLC指紋圖譜研究Δ

目的：建立清痹顆粒的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL。以黃芩苷為參照，測(cè)定10批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2.0版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：10批清痹顆粒的HPLC圖譜有29個(gè)共有峰，相似度均＞0.90。經(jīng)驗(yàn)證，10批樣品HPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為清痹顆粒的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

清痹顆粒；指紋圖譜；高效液相色譜法

清痹顆粒是長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由土茯苓、白花蛇舌草、青風(fēng)藤、絡(luò)石藤、薏苡仁、黃芩、蒼術(shù)、枳實(shí)、香附、大黃、甘草等11味中藥組合而成，用于風(fēng)濕熱痹證的治療，具有清熱解毒、疏風(fēng)除濕、活血通絡(luò)的功效。方中青風(fēng)藤、絡(luò)石藤，一則其性俱涼，功在清熱解毒，二則均為藤類藥材，皆能通經(jīng)入絡(luò)，治一切歷節(jié)風(fēng)痛；土茯苓、白花蛇舌草、黃芩、薏苡仁、枳實(shí)、蒼術(shù)有加強(qiáng)清熱解毒之功，且能除濕利水消腫，尤其是土茯苓、枳實(shí)、蒼術(shù)、薏苡仁能健脾胃、去脾濕、絕水濕之源；香附能活血通絡(luò)行氣；大黃瀉火解毒、活血祛瘀；甘草調(diào)和諸藥；諸藥相合，共達(dá)清熱解毒、疏風(fēng)除濕、活血通絡(luò)之目的。清痹顆粒臨床應(yīng)用廣泛，但質(zhì)量控制目前只限于薄層色譜鑒別，未發(fā)現(xiàn)其指紋圖譜分析研究的報(bào)道。本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立清痹顆粒的指紋圖譜[1]，為進(jìn)一步提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1220型HPLC儀，包括紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

清痹顆粒[長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)：160101、160102、160103、160401、160402、160403、161201、161202、161203、161204（編號(hào)：S1～S10），規(guī)格：5.0 g/袋]；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201016，純度：＞99%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，25%→35%A；30～45 min，35%→40%A；45～60 min，40%A；60～70 min，40%→50%A；70～80 min，50%→60%A；80～90 min，60%→70%A；90～100 min，70%→80%A；100～110 min，80%→90%A；110～115 min，90%→25%A；115～120 min，25%A）[2-6]；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL[2-4]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液稱取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成黃芩苷質(zhì)量濃度為0.098 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取樣品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：160103）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以黃芩苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，29個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.3%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜2.2%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：160103）適量，分別于室溫下放置0、4、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以黃芩苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，29個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD＜1.8%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批樣品（批號(hào)：160103）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以黃芩苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，29個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.0%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜2.3%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2.0版）對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 10批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 batches of samples

圖2 樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 Control HPLC fingerprints of 10 batches of samples

2.4.2 相似度分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2.0版）對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，10批樣品（S1～S10）相似度均＞0.90，表明10批樣品質(zhì)量穩(wěn)定，詳見表1。

表1 10批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 1 Similarity evaluation of 10 batches of samples

2.4.3 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2.0版）對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，10批樣品共有29個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品HPLC圖譜確定4號(hào)峰為黃芩苷。以4號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其他共有峰對(duì)4號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見表2、表3。

表2 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 2 Relative retention time of common peaks inHPLC fingerprints of 10 batches of samples

3 討論

本試驗(yàn)分別對(duì)乙腈-磷酸溶液和甲醇-磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行了考察[5]，結(jié)果，甲醇-0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相（梯度洗脫）時(shí)，其洗脫能力強(qiáng)，所得色譜信息量大，分離度較好。因此，選擇甲醇-0.3%磷酸溶液（梯度洗脫）作為流動(dòng)相。本試驗(yàn)還考察了不同廠家和型號(hào)的色譜柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、ACE C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）[6-7]，結(jié)果，選用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）時(shí)，樣品的分離效果較好。同時(shí)，本試驗(yàn)通過(guò)全波長(zhǎng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在260 nm波長(zhǎng)處時(shí)各色譜峰比例適中，故選擇以260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表3 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 3 Relative peak areas of common peaks in HPLCfingerprints of 10 batches of samples

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)10批清痹顆粒的指紋圖譜分析，標(biāo)定了29個(gè)共有峰，且各共有峰匹配較好，相似度均＞0.90，表明清痹顆粒各批質(zhì)量穩(wěn)定。結(jié)果提示，可利用本指紋圖譜指導(dǎo)生產(chǎn)，以控制藥材對(duì)成品的影響[8-10]，為清痹顆粒的鑒別和質(zhì)量控制提供參考。

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白雪潔1＊，于淼2#，劉秀華3，白雪媛4，李慶杰4（1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，長(zhǎng)春130031；2.長(zhǎng)春三德天晟科技有限公司，長(zhǎng)春130012；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春130012；4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心，長(zhǎng)春130117）

Study on HPLC Fingerprint of Qingbi Granules

BAI Xuejie1，YU Miao2，LIU Xiuhua3，BAI Xueyuan4，LI Qingjie4（1.Dept.of Pharmacy，Changchun Medical College，Changchun 130031，China；2.Changchun Sande Tiansheng Technology Co.，Ltd.Changchun 130012，China；3.Jilin Province Academy of TCM Sciences，Changchun 130012，China；4.Research&Development Center，Changchun University of TCM，Changchun 130117，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of Qingbi granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consisted of methanol-0.3%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 260 nm，and column temperature was 25℃.The sample size was 10 μL.Using baicalin as reference，HPLC chromatograms of 10 batches of samples were determined.Common peak identification and similarity evaluation were performed by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation Software（2.0 edition）.RESULTS：There were 29 common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples.The similarity among the 10 batches was more than 0.90.After validation，HPLC chromatograms of 10 batches of samples were in line with control fingerprints.CONCLUSIONS：Established fingerprints can provide reference for identification and quality evaluation of Qingbi granules.

Qingbi granules；Fingerprint；HPLC

R282.5

A

1001-0408（2017）30-4282-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.28

2017-03-17

2017-06-13）

（編輯：張靜）